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蛋白质和糖学

关注今日：38 | 主题：439858
论坛首页  >  蛋白质和糖学技术讨论版   >  蛋白表达纯化
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【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达 [精华]

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楼主 sunjiankc
sunjiankc
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  • 1楼
这个帖子发布于11年零28天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好，问题是这样，两个蛋白MW分别是36KD和56KD,突变任何一个都失去特异底物的降解能力。
经过序列比对估计这两个蛋白是共同起作用，一个氧化一个还原，从而降解底物。
因此我想设计载体对二者分别表达，同时想做一个共同表达，不知道能不能把两个蛋白连起来放到一个载体里实现共同表达？

谢谢
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2009-11-10 03:54 浏览 : 13235 回复 : 35
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skykiller 编辑于 2009-11-11 14:57
  • • 本科室的科主任天天打压我，当着病人面训我，不想当医生了
laboy
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  • 2楼
好像风险很大，两个蛋白如果连在一起表达，表达出来的就是这2个蛋白的融合结合蛋白了

是否还能保持各自亚基的功能就很难说了。

如果想在一个载体上，单独的，分别表达出2个单体蛋白，貌似不显示，这样需要一个质粒上有2个翻译起始端，我个人是没有看到过这样的文献
2009-11-10 08:38
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dupli
dupli
铁杆站友

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  • 3楼
完全可以，楼主所说共表达不是融合表达，是共同表达。
如果是真核表达，把两个表达框构建到一个载体上进行转化或转染就可以实现共表达了,有一些现成的用于共表达的载体。动物细胞中还有IRES载体可用于共表达。
如果是大肠杆菌或其他原核生物共表达，可以构建两个顺反子到一个载体上，但是步骤可能会比较多，载体比较大，可能会影响质粒复制而影响表达效果。而如果两个顺反子有较大同源部分，则还需要考虑因重组导致的不稳定。
Novagen新出的一款载体pETDuet-1，使用两个T7启动子、两个RBS分别表达两个基因，不过只有一个T7终止子，可以满足楼主的需要。并附质粒图谱。

  • 200905.415.ProNet.pdf(596.42k)
2009-11-10 10:41
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laboy
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  • 4楼
dupli
完全可以，楼主所说共表达不是融合表达，是共同表达。
如果是真核表达，把两个表达框构建到一个载体上进行转化或转染就可以实现共表达了,有一些现成的用于共表达的载体。动物细胞中还有IRES载体可用于共表达。
如果是大肠杆菌或其他原核生物共表达，可以构建两个顺反子到一个载体上，但是步骤可能会比较多，载体比较大，可能会影响质粒复制而影响表达效果。而如果两个顺反子有较大同源部分，则还需要考虑因重组导致的不稳定。
Novagen新出的一款载体pETDuet-1，使用两个T7启动子、两个RBS分别表达两个基因，不过只有一个T7终止子，可以满足楼主的需要。并附质粒图谱。


学习了

新的pETDuet-1这个容易理解，还真有我猜测的 2个翻译起点这样的表达质粒

但是兄台写的真核方案我不是很明白 ，两段序列放在同一个真核表达质粒上，是不是也像原核 一样，需要两个RBS和2个启动子？

我们这边有把2段蛋白，分别构建到同一种载体上，然后共转染293细胞，实现共表达的。

另外我又想到了一个问题，大肠杆菌为什么不能实现2个含有不同表达序列的质粒的共转化和共表达？
2009-11-10 13:45
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laboy 编辑于 2009-11-11 14:00
  • • 暖心！那些让我们坚守在儿科的理由...

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