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蛋白质和糖学

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论坛首页 > 蛋白质和糖学技术讨论版 > 蛋白表达纯化

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【专题讨论】^^^^^不同的目的蛋白在pGEX上表达纯化后，均遇到了一条杂带，看着很诡异（附图）^^^^^ [精华]

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楼主

铁杆站友

36楼

shouhoum
我用的PGEX载体目的蛋白GST-Target 36KD
表达菌株是Rosetta gami 2。 30度诱导五小时 GST柱子纯化

发现纯化后是两条带。有26KD左右的带而且量大于目的蛋白的带。开始怀疑是空载体污染，可是经过酶切发现没有质粒污染。
包涵体纯化发现有微弱目的蛋白，好像没有26KD的条带。请给点建议，如何让我纯化出目的的36KD的条带啊？？？？！！！！！

你这个恐怕是目的片段在表达时就被降解了

解决的方法只能是改诱导条件，或者做成包涵体，这样不容易降解

另外发现一个有意思的事，你怎么能用GST柱子来纯化GST标签蛋白的包涵体呢？？当然挂不住

要在C端加一个6HIS，然后用NI柱

2009-12-28 15:46

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• 世卫组织称新冠病毒变异速度比流感慢

入门站友

37楼

laboy
你这个恐怕是目的片段在表达时就被降解了

解决的方法只能是改诱导条件，或者做成包涵体，这样不容易降解

另外发现一个有意思的事，你怎么能用GST柱子来纯化GST标签蛋白的包涵体呢？？当然挂不住

要在C端加一个6HIS，然后用NI柱

我现在准备37度诱导，菌的表达量低，打算诱导8小时或过夜。请问，对诱导条件有花有什么经验吗？？谢谢，时间很紧
刚才说错了，使用的试剂盒专门亲和GST的

2009-12-28 15:54

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• 调查：你们医院发年终奖吗？

楼主

铁杆站友

38楼

shouhoum
我现在准备37度诱导，菌的表达量低，打算诱导8小时或过夜。请问，对诱导条件有花有什么经验吗？？谢谢，时间很紧
刚才说错了，使用的试剂盒专门亲和GST的

GST柱子，无法亲和包涵体形式的GST融合蛋白。

减轻降解，最好是从缩短诱导时间和降低诱导温度着手吧

2009-12-28 15:59

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• 首张“新冠患者分子全景图”

入门站友

39楼

laboy
GST柱子，无法亲和包涵体形式的GST融合蛋白。

减轻降解，最好是从缩短诱导时间和降低诱导温度着手吧

我们另外还有一个纯化包涵体透析重折叠的试剂盒，所以经常纯化包涵体中的蛋白。目前我就想提高温度和时间，使尽可能多的目的蛋白进入包涵体而不被降解。然后纯化透析包涵体中的目的蛋白。初步打算如此

2009-12-28 16:03

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