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蛋白质和糖学

关注今日：43 | 主题：441357
论坛首页  >  蛋白质和糖学技术讨论版   >  蛋白表达纯化
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【专题讨论】^^^^^不同的目的蛋白在pGEX上表达纯化后，均遇到了一条杂带，看着很诡异（附图）^^^^^ [精华]

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楼主 laboy
laboy
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这个帖子发布于11年零163天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
载体是pGEX
蛋白结构是GST-target protein-6His
纯化是用Ni-IDA纯化包涵体蛋白
电泳是SDS-PAGE变性电泳
不同的目的蛋白，表达均有图上那条比主带低一点的杂带

很奇怪的事
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    换一换
2009-08-13 15:49 浏览 : 9603 回复 : 24
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SmallDonkey 编辑于 2009-08-13 23:49
  • • 公司部门总监，年薪50万+原始股，要不要从医院离职呢？
楼主 laboy
laboy
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  • 2楼
个人的一些分析：
从这个图上看
1，  这个低分子杂带的大小不均一，如果是GST-tag单独表达的话，应该是均一的26KD
2，  这个低分子杂带的大小随目的蛋白的大小成正比，也就是说有可能和目的蛋白有关

这个低分子杂蛋白被纯化出来有2种可能模式
1，  被NI柱纯化出来，可能带HIS（不一定是6HIS有可能是4HIS，5HIS） or Cysteine or Tryptophan
2，  粘附在GST-Target-6His这个蛋白上被共纯化出来。(很有可能粘附在GST上)

这个普遍存在的低分子量杂蛋白的来源也有2种可能
1，表达菌株本身gene翻译的蛋白
2，我们转化进去的质粒翻译的蛋白

不过我个人更倾向于质粒翻译的蛋白，因为如果是菌体本身的蛋白，应该是同一种杂蛋白，分子量不可能随目的蛋白的大小不同而不同
2009-08-13 15:53
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laboy 编辑于 2009-08-13 16:00
  • • 教育部：今年国家定向培养免费医学生 ，你会报考吗？——回帖
skykiller
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丁香园荣誉版主

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  • 3楼
是pGEX载体的原因，我也遇到过相同情况，甚至构建的思路都相同，哈哈。
很多文献或资料上都说是表达提前终止，我很有些怀疑。就像你的纯化情况一样，如果是表达提前终止的话，那个小的杂带不应该带有his，纯化时提前终止的蛋白不能吸附于Ni柱。在我的试验中，这条比完整的融合蛋白小的条带对GST亲和柱的吸附也不好，而完整的融合蛋白可以吸附得非常好。所以，这条小带也不完全是GST融合头的部分。
我推测，小条带产生的原因可能在于，菌体在表达融合蛋白时，大肠杆菌的自身酶或别的什么因素使得融合蛋白从N端断裂了一小段或几小段，留下的是C端的蛋白，就是你电泳上的小条带。这个推测也有一个矛盾之处，那就是为什么空载体表达GST时没有断裂？
纯化去除这条小带可以用GST亲和柱以及离子交换柱来完成。
2009-08-13 16:08
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skykiller 编辑于 2009-08-13 16:20
  • • 病史长达15年的老烂腿，多家医院诊疗无果，疼痛难忍……
楼主 laboy
laboy
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  • 4楼
skykiller
是pGEX载体的原因，我也遇到过相同情况，甚至构建的思路都相同，哈哈。
很多文献或资料上都说是表达提前终止，我很有些怀疑。就像你的纯化情况一样，如果是表达提前终止的话，那个小的杂带不应该带有his，纯化时提前终止的蛋白不能吸附于Ni柱。在我的试验中，这条比完整的融合蛋白小的条带对GST亲和柱的吸附也不好，而完整的融合蛋白可以吸附得非常好。所以，这条小带也不完全是GST融合头的部分。
我推测，小条带产生的原因可能在于，菌体在表达融合蛋白时，大肠杆菌的自身酶或别的什么因素使得融合蛋白从N端断裂了一小段，留下的是C端的蛋白，就是你电泳上的小条带。
纯化去除这条小带可以用GST亲和柱以及离子交换柱来完成。

恩，分析的有道理

还有一个现象，电泳上看，主带和杂带之间的距离是差不多的，也就是说，主带和杂带的分子量差是差不多的。（差10KD的样子）
我的目的蛋白大概在15-25KD之间+26KD GST

所以我猜测有可能是GST发生了断裂，掉了10KD左右的一段。

另外一个佐证是，采用同样的表达体系和模式的一批（4个）不同可溶表达蛋白，我用GST柱子来纯化上清，得到的蛋白则没有上述这个低分子的杂带，也就是说可溶表达的情况下，N端GST是完整的，没有断裂。

现在有点肯定是GST断裂了，新的问题又出来了是表达的时候断了呢还是超声的时候断了？
2009-08-13 16:36
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laboy 编辑于 2009-08-13 16:52
  • • 每天鼻塞流涕，一年四季“感冒”，这是为什么呢

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