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蛋白质和糖学

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论坛首页  >  蛋白质和糖学技术讨论版   >  Western Blot/IP
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【求助】谁能给讲讲封闭的原理? [精华]

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zhao22840718
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  • 71楼
最近用0.2孔径的膜,对封闭有一些体会,和大家交流一下。millipore 0.2的膜吸附蛋白能力很强,如果常规方法封闭,NC膜封闭一个小时就可以,而0.2的膜如果按这个条件,背景很高,几乎完全盖住目的条带。但有一些表达量不高,分子量较小的蛋白用0.2的膜还是必需的。我改进条件,4度封闭过夜,然后洗脱时间延长,效果就改善了。

如前面战友所说,封闭降低背景,应该是因为封闭液与膜上能非特异性吸附蛋白的位点结合,非特异性吸附蛋白的位点结合掉以后,当一抗或二抗(蛋白)加入时,不会再与膜非特异性结合了。(这种结合可以是疏水作用,离子键,共价键等)

至于非特异性条带,封闭条件优化一下应该能降低或去除。但我觉得没有太大必要去除。因为抗体特异性不一定很强。再者有很多未知的蛋白与蛋白相互作用,蛋白跟蛋白之间的相互作用,也能发生在非目的蛋白与抗体之间。只用我们所要的目的蛋白变化明显就足够了。
2009-09-27 14:30
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  • 72楼
不用那么麻烦 奶粉用小牛初乳就可以 我做过脑脊液与神经脱髓鞘的研究 ,那些单一抗体 比如IgG寡克隆 就是很好的例子,如果在转膜是把气泡赶走就可以
2009-09-27 14:41
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封闭的目的---阻滞膜对抗体的非特异性吸附
2009-09-27 23:41
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  • 74楼
不过呢,如果一抗是羊源的抗体,一定要用BSA,否则,奶粉中的很多成分可以被羊源抗体识别,只能得到黑膜。
2009-09-28 09:49
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