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【求助】谁能给讲讲封闭的原理？ [精华]

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丁香园准中级站友

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71楼

最近用0.2孔径的膜，对封闭有一些体会，和大家交流一下。millipore 0.2的膜吸附蛋白能力很强，如果常规方法封闭，NC膜封闭一个小时就可以，而0.2的膜如果按这个条件，背景很高，几乎完全盖住目的条带。但有一些表达量不高，分子量较小的蛋白用0.2的膜还是必需的。我改进条件，4度封闭过夜，然后洗脱时间延长，效果就改善了。

如前面战友所说，封闭降低背景，应该是因为封闭液与膜上能非特异性吸附蛋白的位点结合，非特异性吸附蛋白的位点结合掉以后，当一抗或二抗（蛋白）加入时，不会再与膜非特异性结合了。（这种结合可以是疏水作用，离子键，共价键等）

至于非特异性条带，封闭条件优化一下应该能降低或去除。但我觉得没有太大必要去除。因为抗体特异性不一定很强。再者有很多未知的蛋白与蛋白相互作用，蛋白跟蛋白之间的相互作用，也能发生在非目的蛋白与抗体之间。只用我们所要的目的蛋白变化明显就足够了。

2009-09-27 14:30

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• 前纵隔占位，三天后公布病理结果

入门站友

72楼

不用那么麻烦奶粉用小牛初乳就可以我做过脑脊液与神经脱髓鞘的研究，那些单一抗体比如IgG寡克隆就是很好的例子，如果在转膜是把气泡赶走就可以

2009-09-27 14:41

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常驻站友

73楼

封闭的目的---阻滞膜对抗体的非特异性吸附

2009-09-27 23:41

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常驻站友

74楼

不过呢，如果一抗是羊源的抗体，一定要用BSA，否则，奶粉中的很多成分可以被羊源抗体识别，只能得到黑膜。

2009-09-28 09:49

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