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【求助】谁能给讲讲封闭的原理？ [精华]

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常驻站友

36楼

skykiller
好贴子，总结一下，大家继续讨论。

1、封闭液中的蛋白可以与膜上的空白位置结合。
大家都同意，尤其是supermaltose战友的描述非常生动。

2、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白是一种吸附覆盖作用，无选择性。
zzz198506战友的观点。

3、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白是一种吸附覆盖作用，但根据所用封闭蛋白的不同有选择性。
laboy战友的观点。

4、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白是一种竞争性洗脱作用，无选择性。
skykiller的观点。

5、封闭可以用化学方法，如甲醛封闭PVDF膜。
高正祥战友提问，laboy战友解释。

我私下认为zzz198506战友的观点更有道理。

2009-09-18 22:25

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• 饶毅顶刊发文，公开质疑上海药物所耿美玉团队文章！

cn981

常驻站友

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37楼

楼上说的都很精彩，借你们的文字和理论，我也自己总结一下，对错与否，恳请赐教。

1、转膜后蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于膜上，这种结合是很牢固的。
2、封闭液中的蛋白可以与膜上的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合，所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。
3、同时，封闭液中的蛋白与膜上的蛋白（抗原决定簇）进行非特异性结合，说明与目的蛋白也是有结合的。但这种结合强度不强，起码比1或2的结合方式要弱得多。
4、不排除“封闭液中的蛋白与膜上的蛋白存在一种竞争性洗脱作用，无选择性”。但应该说这种竞争是很微弱的，因为原来在膜上的蛋白和膜结合得很牢固，这种洗脱作用不至于对膜上蛋白的数量造成实质性影响。
5、一抗和目的蛋白的结合是特异性结合，这种结合力比较强。
6、结合能力比较：1＞2≥5＞3
7、理由：
a、抗体洗脱液可以洗脱抗体，却不能洗脱膜上的蛋白，故2≥5。（另外，洗涤剂如免疫组化的PBS或wetern的TBST无法洗脱2和5、3这三种结合，只是洗去未结合一抗。因为在加二抗前有洗涤，如果能洗脱的话，二抗就会取代被洗掉的蛋白而与膜或其他蛋白产生非特异结合。所以，在封闭后也可洗涤也可不洗涤，但不洗会保险一点，因为在都封闭的情况下，一抗终究会取代封闭液中的蛋白。）
b、1和2有着相同的结合方式，但1的机械填补是在电场的作用下完成的，综合起来认为1＞2。
c、一抗和目的蛋白的结合是特异性的，这种结合在封闭后进行就存在这一抗和封闭液中蛋白对目的蛋白的竞争，但这种竞争很不平衡，因为特异性结合比非特异性结合牢固得多（5＞3），也就是说一抗最终肯定取代封闭液中的蛋白结合在目的蛋白上；但毕竟是存在着竞争，所以一抗的取代不是完全绝对的，还受封闭液的浓度等因素的影响，因此，封闭液的不同会影响一抗和目的蛋白的结合率，也就解释了封闭时间长短，浓度会影响目的条带的现象。虽然这种影响很微弱。
8、最后，结合的强弱都是相对的，非特异条带的出现首要考虑一抗的特异性，其他只是辅助因素，只有衡量利弊，才能有合适的实验方案。

2009-09-19 01:30