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【求购】哪位能发一下CTAB法提RNA的步骤

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湖风微竹

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1楼

这个帖子发布于11年零104天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

哪位能发一下CTAB法提RNA的步骤，先谢过！！！

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2009-06-09 17:55 浏览 : 5361 回复 : 1

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starseacow

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2楼

试材及用具
试材:植物幼嫩组织（如幼叶、花器、幼根）。
仪器、用具:离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪、电泳槽等。
需配置的药品和缓冲液:
CTAB提取RNA缓冲液为：2% CTAB(W/V)，2% PVP(W/V)，25 mmol/L EDTA，100 mmol·L-1 Tris-Cl pH 8.0，2.0 mol·L-1 NaCl， 0.5 g·L-1 Spermidine（亚精胺）。灭菌后加入2%（V/V）ß-巯基乙醇。
SSTE buffer为：1.0 mol/L NaCl，0.5%SDS，10 mmol/L Tris-Cl pH 8.0，1 mmol/L EDTA。
TE(pH 8.0): 称取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2 ，先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH 8.0，再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。
氯仿/异戊醇（24:1,v/v）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。
酚: 氯仿:异戊醇(25:24:1):按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。
5× RNA电泳缓冲液的配制：依次加入以下成分: 10.46 g MOPS 、1.7 g乙酸钠，0.93 g EDTA，调pH 7.0，定容到500 mL。
RNA 加样缓冲液:1 mmol/L EDTA pH 8.0、0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯青、50%甘油，高压灭菌。

方法步骤
（1）65°C水浴中预热15 mL CTAB提取液。
（2）液氮中研磨2～3 g新鲜或-70°C冷冻的材料。
（3）转移样品至有CTAB提取液的离心管中，立即激烈涡旋30s，短时放回 65°C水浴中（4～5 min）。
（4）加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合，10000 rpm常温离心15 min。
（5）将上清转移至一新离心管。重复抽提一次。
（6）将上清转移至一新离心管中，加入8 mol/L LiCl, 使LiCl的终浓度为2 mol·L-1，即加入1/3体积的LiCl，4°C下沉淀过夜（最多16h）。
（7）4°C离心1 h(全速)，弃上清，用500 μL70%乙醇洗沉淀，然后用500 μL100% 乙醇洗沉淀。
（8）用500 μL SSTE 溶解沉淀，转移至1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。
（9）加入2×体积的无水乙醇，在-70°C沉淀30 min或-20°C沉淀2 h。
（10）4°C离心20 min沉淀RNA（全速）。
（11）先用400 μL70%乙醇洗沉淀，然后用400 μL100%乙醇洗沉淀，吹干后用65 μLDEPC水溶解RNA。

用DNase处理提取的RNA：
（1）用65μLDEPC水溶解RNA沉淀。
（2）加入 10×DNase assay buffer 7.5 μL
RNase inhibitor 1.0 μL
DNase Ⅰ 1.5 μL
（3）37°C水浴20min。
（4）调整样品体积至250 μL（加入175 μLDEPC水）。
（5）加入1/10体积3 mol/L NaAc(pH=5.2),即25μL，颠倒管子或涡旋混匀。
（6）加入2×体积冷的无水乙醇，混匀后，储存在-20°C 30 min。
（7）4°C离心20 min，沉淀RNA (全速)。
（8）用70%乙醇洗沉淀，然后用无水乙醇洗沉淀。
（9）吹干后，用50 μLDEPC水溶解RNA。置-70°C冰箱中保存。

电泳检测RNA：
（1）配制1.2%的琼脂糖凝胶（20mL）
称取琼脂糖0.24 g，加DEPC处理的ddH2O 12.04 mL，5×RNA 电泳缓冲液4 mL，电炉加热融化琼脂糖，冷却至55°C，加入甲醛1.96 mL，冷却后倒胶。
（2）RNA电泳
取去离子甲酰胺10 μL，甲醛1.5 μL，10× RNA Buffer 2 μL，RNA (2～4 μg, <10 μL) 混合液，65°C加热15min，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入3 μL RNA 加样缓冲液和0.5 μL EB，上样电泳。电泳Buffer 为1× RNA buffer。
出现的电泳条带有两条，是两条最大的核糖体RNA（rRNA）分子，即18S 和28S rRNA，较小的RNA也很丰富但看不到，因为太小，跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNA（mRNA）经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28S rRNA带亮，且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍，说明提取的RNA没有发生降解，纯度好。
RNA提取有其他多种方法，整个流程下来所用时间不同，如专门的试剂盒Trizol可在1.5h内完成RNA的提取工作，但得率较低，适合草本类植物，木本类植物用CTAB法提取的RNA可在1.5d内完成，但得率高，此法可获大量的RNA用于Northern杂交、基因克隆等工作。

提取的RNA的浓度检测
（1）取少量待测RNA样品，用TE或蒸馏水稀释50倍（或100倍）。
（2）用TE或蒸馏水做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。
（3）加入待测RNA样品在三个波长处读取OD值。
(4) 纯RNA 样品的OD260/OD280 大约为2.0。
（5）根据OD值计算RNA浓度或纯度。
[SSRNA]=40×（OD260-OD310）×稀释倍数

2009-06-09 18:42

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