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植物与农林科学

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论坛首页  >  植物学与农林科学讨论版   >  植物分子生物学
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【求购】哪位能发一下CTAB法提RNA的步骤

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楼主 湖风微竹
湖风微竹
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这个帖子发布于11年零313天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
哪位能发一下CTAB法提RNA的步骤,先谢过!!!
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2009-06-09 17:55 浏览 : 5741 回复 : 1
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starseacow
starseacow
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试材及用具
试材:植物幼嫩组织(如幼叶、花器、幼根)。
仪器、用具:离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪、电泳槽等。
需配置的药品和缓冲液:
CTAB提取RNA缓冲液为:2% CTAB(W/V),2% PVP(W/V),25 mmol/L EDTA,100 mmol·L-1 Tris-Cl pH 8.0,2.0 mol·L-1 NaCl, 0.5 g·L-1 Spermidine(亚精胺)。灭菌后加入2%(V/V)ß-巯基乙醇。
SSTE buffer为:1.0 mol/L NaCl,0.5%SDS,10 mmol/L Tris-Cl pH 8.0,1 mmol/L EDTA。
TE(pH 8.0): 称取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2 ,先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解,用盐酸调pH 8.0,再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。
氯仿/异戊醇(24:1,v/v): 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀,置棕色瓶中,4℃保存。
酚: 氯仿:异戊醇(25:24:1):按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀,置棕色瓶中,4℃保存。
5× RNA电泳缓冲液的配制:依次加入以下成分: 10.46 g MOPS 、1.7 g乙酸钠,0.93 g EDTA,调pH 7.0,定容到500 mL。
RNA 加样缓冲液:1 mmol/L EDTA pH 8.0、0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯青、50%甘油,高压灭菌。

方法步骤
(1)65°C水浴中预热15 mL CTAB提取液。
(2)液氮中研磨2~3 g新鲜或-70°C冷冻的材料。
(3)转移样品至有CTAB提取液的离心管中,立即激烈涡旋30s,短时放回 65°C水浴中(4~5 min)。
(4)加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合,10000 rpm常温离心15 min。
(5)将上清转移至一新离心管。重复抽提一次。
(6)将上清转移至一新离心管中,加入8 mol/L LiCl, 使LiCl的终浓度为2 mol·L-1,即加入1/3体积的LiCl,4°C下沉淀过夜(最多16h)。
(7)4°C离心1 h(全速),弃上清,用500 μL70%乙醇洗沉淀,然后用500 μL100% 乙醇洗沉淀。
(8)用500 μL SSTE 溶解沉淀,转移至1.5 mL离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。
(9)加入2×体积的无水乙醇,在-70°C沉淀30 min或-20°C沉淀2 h。
(10)4°C离心20 min沉淀RNA(全速)。
(11)先用400 μL70%乙醇洗沉淀,然后用400 μL100%乙醇洗沉淀,吹干后用65 μLDEPC水溶解RNA。

用DNase处理提取的RNA:
(1)用65μLDEPC水溶解RNA沉淀。
(2)加入 10×DNase assay buffer 7.5 μL
RNase inhibitor 1.0 μL
DNase Ⅰ 1.5 μL
(3)37°C水浴20min。
(4)调整样品体积至250 μL(加入175 μLDEPC水)。
(5)加入1/10体积3 mol/L NaAc(pH=5.2),即25μL,颠倒管子或涡旋混匀。
(6)加入2×体积冷的无水乙醇,混匀后,储存在-20°C 30 min。
(7)4°C离心20 min,沉淀RNA (全速)。
(8)用70%乙醇洗沉淀,然后用无水乙醇洗沉淀。
(9)吹干后,用50 μLDEPC水溶解RNA。置-70°C冰箱中保存。

电泳检测RNA:
(1)配制1.2%的琼脂糖凝胶(20mL)
称取琼脂糖0.24 g,加DEPC处理的ddH2O 12.04 mL,5×RNA 电泳缓冲液4 mL,电炉加热融化琼脂糖,冷却至55°C,加入甲醛1.96 mL,冷却后倒胶。
(2)RNA电泳
取去离子甲酰胺10 μL,甲醛1.5 μL,10× RNA Buffer 2 μL,RNA (2~4 μg, <10 μL) 混合液,65°C加热15min,迅速在冰浴中冷却片刻,然后加入3 μL RNA 加样缓冲液和0.5 μL EB,上样电泳。电泳Buffer 为1× RNA buffer。
出现的电泳条带有两条,是两条最大的核糖体RNA(rRNA)分子,即18S 和28S rRNA,较小的RNA也很丰富但看不到,因为太小,跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNA(mRNA)经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28S rRNA带亮,且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍,说明提取的RNA没有发生降解,纯度好。
RNA提取有其他多种方法,整个流程下来所用时间不同,如专门的试剂盒Trizol可在1.5h内完成RNA的提取工作,但得率较低,适合草本类植物,木本类植物用CTAB法提取的RNA可在1.5d内完成,但得率高,此法可获大量的RNA用于Northern杂交、基因克隆等工作。

提取的RNA的浓度检测
(1)取少量待测RNA样品,用TE或蒸馏水稀释50倍(或100倍)。
(2)用TE或蒸馏水做空白,在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。
(3)加入待测RNA样品在三个波长处读取OD值。
(4) 纯RNA 样品的OD260/OD280 大约为2.0。
(5)根据OD值计算RNA浓度或纯度。
[SSRNA]=40×(OD260-OD310)×稀释倍数
2009-06-09 18:42
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