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【专题讨论】Western Blot前煮蛋白对结果真的没影响吗？

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楼主

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1楼

这个帖子发布于10年零121天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

做western blot近两年了，虽然不敢说精通，但是掌握是应该的了。
以前，就对煮蛋白这一环节有点不理解，但是还是照做下来。
最近，闲着无聊，就想把以前的疑惑拿来验证一下，结果让我更加疑惑。
煮蛋白之前每组蛋白浓度均用分光光度计测定，然后加上样缓冲液、煮蛋白5分钟，接着根据测得的蛋白浓度上样，每孔蛋白含量一样。与以前不一样的是，我预留一孔加没经过煮沸这一环节的蛋白。最后按常规电泳、转膜、依次加一抗、二抗孵育，结果曝光的片子，没有煮的那孔β-actin条带灰度值明显比其他的大，而其他孔的灰度值基本一致。
这是什么原因呢？
我想了以下两个原因：
（1）煮沸组：离心管盖子松弛，导致部分蛋白蒸发。但是，表面来看，所有离心管盖子都是紧盖着的。由于已经加了上样缓冲液，考马斯亮蓝法已无法再测其蛋白浓度。不知是否还有其他方法测其蛋白浓度？
（2）煮沸可能破坏了蛋白的抗原性。
不知诸位高手有何意见和看法？

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2009-03-22 23:13 浏览 : 21669 回复 : 14

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• 产妇亲妈坚决不让剖宫产，最终导致胎儿重度窒息死亡

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zhaofeng1919

铁杆站友

3楼

是的，必须变性，一个是变性后蛋白空间结构破坏，只保留一级结构，消除电泳时空间结构对于迁移率的影响，第二是保露出蛋白内在的抗原，因为wb的抗体不能是空间性的，只有变性后抗体才能充分和抗原结合。

2009-03-23 11:27

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• 丁香热议 — 医院就是江湖，有5句话，在医院别乱说

fangweibin119

丁香园准中级站友

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2楼

灵珠子
做western blot近两年了，虽然不敢说精通，但是掌握是应该的了。
以前，就对煮蛋白这一环节有点不理解，但是还是照做下来。
最近，闲着无聊，就想把以前的疑惑拿来验证一下，结果让我更加疑惑。
煮蛋白之前每组蛋白浓度均用分光光度计测定，然后加上样缓冲液、煮蛋白5分钟，接着根据测得的蛋白浓度上样，每孔蛋白含量一样。与以前不一样的是，我预留一孔加没经过煮沸这一环节的蛋白。最后按常规电泳、转膜、依次加一抗、二抗孵育，结果曝光的片子，没有煮的那孔β-actin条带灰度值明显比其他的大，而其他孔的灰度值基本一致。
这是什么原因呢？
我想了以下两个原因：
（1）煮沸组：离心管盖子松弛，导致部分蛋白蒸发。但是，表面来看，所有离心管盖子都是紧盖着的。由于已经加了上样缓冲液，考马斯亮蓝法已无法再测其蛋白浓度。不知是否还有其他方法测其蛋白浓度？
（2）煮沸可能破坏了蛋白的抗原性。
不知诸位高手有何意见和看法？

煮沸让蛋白变性
如果有还原剂的话打开二硫键结构、变成直线性
SDS包围蛋白
这样电泳时只取决于分子量大小

2009-03-23 08:38

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• 千分之五的患病率，就在我坐门诊 1 个月碰到了

zhaofeng1919

铁杆站友

3楼

2009-03-23 11:27

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