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【专题讨论】Western Blot前煮蛋白对结果真的没影响吗?

最后编辑于 2022-10-09 · IP 江苏江苏
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这个帖子发布于 16 年零 106 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
做western blot近两年了,虽然不敢说精通,但是掌握是应该的了。
以前,就对煮蛋白这一环节有点不理解,但是还是照做下来。
最近,闲着无聊,就想把以前的疑惑拿来验证一下,结果让我更加疑惑。
煮蛋白之前每组蛋白浓度均用分光光度计测定,然后加上样缓冲液、煮蛋白5分钟,接着根据测得的蛋白浓度上样,每孔蛋白含量一样。与以前不一样的是,我预留一孔加没经过煮沸这一环节的蛋白。最后按常规电泳、转膜、依次加一抗、二抗孵育,结果曝光的片子,没有煮的那孔β-actin条带灰度值明显比其他的大,而其他孔的灰度值基本一致。
这是什么原因呢?
我想了以下两个原因:
(1)煮沸组:离心管盖子松弛,导致部分蛋白蒸发。但是,表面来看,所有离心管盖子都是紧盖着的。由于已经加了上样缓冲液,考马斯亮蓝法已无法再测其蛋白浓度。不知是否还有其他方法测其蛋白浓度?
(2)煮沸可能破坏了蛋白的抗原性。
不知诸位高手有何意见和看法?







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