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植物与农林科学
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植物学与农林科学讨论版
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植物分子生物学
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【求助】叶盘法转化烟草
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kellysamy
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丁当
1楼
这个帖子发布于
12年零58天
前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好,我近期准备用叶盘法转化烟草。由于从来没有做过植物的转化工作。很怕到时会出什么大毛病。
在这里,恳请各位有经验前辈能给我一点经验指导和建议。特别是注意事项和关键操作要点方面如能得到指导。将不甚感激。谢谢
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2009-02-19 10:22
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bired
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丁当
2楼
按照文献来,没有什么大的困难的
2009-02-22 19:37
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zhuzhu19
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丁当
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3楼
1 无菌材料的准备
将烟草种子用纯净水冲洗干净,然后置于70%乙醇中浸泡1min,用无菌滤纸包裹住,用无菌水冲洗一次。2% 次氯酸钠浸泡10min,然后用无菌水冲洗3次。最后将种子转接到MS基本培养基上培养2-3周。培养条件为:温度25℃,光照强度1500Lax,16h光照/8h黑暗。
2 烟草再生体系的建立
取无菌苗的叶片,去中脉和叶缘,剪成0.5cm2左右的外植体小片,接种于分化培养基上培养。待长出大约2cm左右长的无菌芽时,将小芽切下转接MS基本培养基进行生根培养。
3 用于转化烟草的农杆菌菌液的准备
4 烟草叶盘法转化
(1)将上述准备好的农杆菌菌液取10mL左右转移到一个空的无菌培养皿中;
(2)将烟草叶片去中脉和叶缘,切成0.5~0.8cm×0.5~0.8cm的均匀小片;
(3)将叶片转移到菌液中,轻轻振荡侵染5~8min;
(4)用镊子将叶盘夹到灭菌过的滤纸上,吸干残留在叶片上的菌液;
(5)将小叶片转移到共培养培养基上,在培养基表面附加一层灭过菌的滤纸,将叶片正面向上放在滤纸上,封口膜封皿;同时将未经农杆菌侵染的叶盘放入同样的共培养基上作为阴性对照。
(6)28ºC暗处共培养2~3天;
(7)共培养之后,将转化处理的叶盘浸于MS液体培养基中3~5min。无菌滤纸吸取残留液,转到选择分化培养基上,同时将对照叶盘也进行同样的处理。
(8)于光照培养箱中培养,条件为24ºC光照16h。
(9)转化后根的再生:转化约6周后,将分化的抗性芽切下,转入选择生根培.养基上,10~15d后可见生根。
2009-02-23 20:41
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lk9908
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丁当
4楼
学习了~~~~~~~
2009-04-30 12:04
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