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植物与农林科学
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植物学与农林科学讨论版
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植物分子生物学
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【求助】叶盘法转化烟草
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楼主
kellysamy
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丁当
1楼
这个帖子发布于
12年零58天
前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好，我近期准备用叶盘法转化烟草。由于从来没有做过植物的转化工作。很怕到时会出什么大毛病。
在这里，恳请各位有经验前辈能给我一点经验指导和建议。特别是注意事项和关键操作要点方面如能得到指导。将不甚感激。谢谢
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2009-02-19 10:22
浏览 : 6001
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bired
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丁当
2楼
按照文献来，没有什么大的困难的
2009-02-22 19:37
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zhuzhu19
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丁当
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3楼
1 无菌材料的准备
将烟草种子用纯净水冲洗干净，然后置于70%乙醇中浸泡1min，用无菌滤纸包裹住，用无菌水冲洗一次。2% 次氯酸钠浸泡10min，然后用无菌水冲洗3次。最后将种子转接到MS基本培养基上培养2-3周。培养条件为：温度25℃，光照强度1500Lax，16h光照/8h黑暗。
2 烟草再生体系的建立
取无菌苗的叶片，去中脉和叶缘，剪成0.5cm2左右的外植体小片，接种于分化培养基上培养。待长出大约2cm左右长的无菌芽时，将小芽切下转接MS基本培养基进行生根培养。
3 用于转化烟草的农杆菌菌液的准备
4 烟草叶盘法转化
（1）将上述准备好的农杆菌菌液取10mL左右转移到一个空的无菌培养皿中；
（2）将烟草叶片去中脉和叶缘，切成0.5~0.8cm×0.5~0.8cm的均匀小片；
（3）将叶片转移到菌液中，轻轻振荡侵染5~8min；
（4）用镊子将叶盘夹到灭菌过的滤纸上，吸干残留在叶片上的菌液；
（5）将小叶片转移到共培养培养基上，在培养基表面附加一层灭过菌的滤纸，将叶片正面向上放在滤纸上，封口膜封皿；同时将未经农杆菌侵染的叶盘放入同样的共培养基上作为阴性对照。
（6）28ºC暗处共培养2~3天；
（7）共培养之后，将转化处理的叶盘浸于MS液体培养基中3~5min。无菌滤纸吸取残留液，转到选择分化培养基上，同时将对照叶盘也进行同样的处理。
（8）于光照培养箱中培养，条件为24ºC光照16h。
（9）转化后根的再生：转化约6周后，将分化的抗性芽切下，转入选择生根培.养基上，10~15d后可见生根。
2009-02-23 20:41
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lk9908
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丁当
4楼
学习了~~~~~~~
2009-04-30 12:04
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