【经验】最优化的神经球传代方法（附思考题两则）[补充：神经球冻存之优化] [精华]

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1楼

这个帖子发布于12年零299天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

最近在园子里出没得多了，一日被版主lits逮住，说希望我能在本版主持一个神经干细胞相关的专题讨论，当时是欣然同意的，只是犹豫未决：以理论探讨为主？还是实验交流为重？

于是回顾了版中数年内的旧贴，包括干细胞版中的一些相关贴，发现提问最多的还是：为什么神球状态不好？为什么神经球会贴壁？为什么神经干细胞容易分化？等等。

由此可见国内多数着眼于此的实验室还处于起步阶段，很多新手还在为无法得到实验需求的细胞而烦恼。对他们来说，现在最感兴趣的必定是一个门槛低，重复性好的方法；对理论的兴趣不是没有，只是排在其次。

而且，一谈到理论问题，那么我所持有的更多的是来自于阅读，也就是第二手或第三手的知识，再经我传达出来，那就是第三手第四手的东西。就像传话游戏一样，由于我个人识见的偏颇，也许无意中导致传达的谬误。此时如果没有人跳出给我纠错，那就会误人，不由得战战兢兢。

因此，我想先讲一讲自己的经验，也许看起来不过是芝麻似的小技巧，但那是亲手千锤百炼所得，行之有效，说得也更有信心。

好，闲说少叙，进入正题。
本贴中我展示的是神经球培养过程中不可避免的重要过程：传代。

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2008-07-01 00:56 浏览 : 17296 回复 : 53

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wangbadan 编辑于 2008-07-02 21:05

• 医学统考67分心得

楼主

wangbadan

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2楼

大多数讲NSCs的书或protocol都更偏重于原代细胞的获取，对传代方法往往一笔带过，所以很多新手在取材方面基本上问题不太，反而在传代时困难重重。

那么神经球的传代究竟难在哪儿呢？

神经干细胞、神经球——这名字就已经提示了难处之所在。

首先，在所有体外培养体系中，神经细胞培养之难是众所周知的。虽然1906年开创组织培养之先河的R. G. Harrison用的就是神经组织，但那毕竟是大块组织，而且只是短期培养。1976年，Bottenstein和Sato使用N2添加剂成功培养神经元细胞系，但对原代神经元的低密度培养体系仍是无能为力。直到1993年，由于B27添加剂的发明和商品化，低密度原代神经元的长期培养才成为现实。因此，神经干细胞继承了神经元这种苍白羸弱的贵族气也不难理解。

其次，作为干细胞，本身就是未充分发育的，就像早产儿，总得需要更多外界的支持的力量才存活得下去。更轻柔的操作，生长因子的添加等，都不可或缺。而且，干细胞就像一个处于高势能位的球体，条件一旦不合意，就会向下滚落而进入分化状态。

再次，神经球是一个三维立体，较之于平面培养，每个细胞都有更多的邻居，处理起来困难可想而知。

让我们直面这些困难，像西腊神话中不休的西绪福斯一样，将神经球之战进行到底吧。

2008-07-01 00:57

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wangbadan 编辑于 2008-07-01 01:21

• 新冠疫苗的奥秘——如何选择疫苗抗原？（转载）

楼主

wangbadan

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3楼

步骤－1：
在每次传代之前，我们有两件事要做：
其一，确定神经球状态好不好。
其二，掌握最佳传代时机。

什么样的神经球是状态良好的？这恐怕是一个纯经验性的判断，而无法量化。以我来看，活力好的神经球通常是折光均匀的，边缘明亮锐利。多数时候可以见到细小的棘刺（如下图A），这说明细胞有活跃的actin在聚合/解聚，是活力好的明证。

传代时间要从两个方面考虑：
1）球的直径（体积）不能过大。太大的球，其内部细胞难以及时得到营养支持，可能走向凋亡或死亡；即使没有死亡，内部细胞与外部细胞环境差异甚大，极有可能发生不定向分化。可以根据个人经验确定上个直径的上下限，超过这上极限的细胞球宁可舍弃，低于下极限的可以不传。我一般定在200~300um（如下图B、C）。
2）如果估计在较长时间内（>3天），球达不到上述传代极限，那可酌情每日添加少量培养基，比如1~2ml，或者隔日半量换液。至于原因，大概不用我多说了吧。