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【求助】klenow酶补平的苦恼?急

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楼主

常驻站友

1楼

这个帖子发布于11年零169天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

大家好,又要麻烦大家了.我用分步酶切法把我的质粒切出我的目的片段,并且用胶回收了,再用KLENOW酶来补平粘性末段,可是觉得我的补平不全.请问怎么样才能说明我的补平比较彻底的,还有我用的是NEB 的产品,体系如下:
DNA: 10UL
10XNEBbuffer2: 2ul
dNTP: 0.7UL
klenow: 1ul
ddH2O: 6.3UL
25度温育15分钟
最后用75度 20分钟灭活klenow酶

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2008-04-08 13:03 浏览 : 7742 回复 : 4

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fengwang191

铁杆站友

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3楼

不知道你的实验是否顺利，有段时间没有来丁香园了。在你的原先的帖子中已经给过你回复了，现在再跟你说一遍吧。
你不要先回收再进Klenow补平，只需要在酶切反应体系中做Klenow补平反应即可，因为BUFFER通用，这样很方便，而且损失少，要不你至少要回收两次。其中dNTP、Klenow酶、温度，反应时间均要严格控制，否则很容易造成末端凹陷或者不平。你以上的体系很有可能造成这个结果，因为你的DNA量、dNTP、Klenow酶的用量就很有可能不正确。
我就将我的一些经验值告诉你，希望对你能有所帮助吧
做Klenow补平的事情，处理2ug的DNA，在你的酶切后的反应体系中加入的量分别为：
dNTP（dATP,dTTP,dGTP,dCTP 10mM each ）(也就是最常用的dNTPs): 0.5ul
DNA聚合酶 I(Klenow 大片段)：0.5ul
（切忌不要用成Klenow Fragment（3'->5'exo-））
对于处理其他初始量的NDA来说只需要根据2ug的比例来算一下即可。
25°C15分钟后，直接过柱子回收（市场上有很多PCR&DNA产物纯化试剂盒）本人不是很喜欢NEB推荐的EDTA和加热的方法来终止，比较麻烦（NEB可别拍砖啊）
回收完你就可以进行下一步的酶切了。
至于载体CIP去磷酸化的条件，几乎不用考虑（只是经验谈啊，因为我是一直这么做的），只需要在酶切反应体系中加入0.5ul的CIP酶，放入37°C水浴锅中30min-1h即可取出进行电泳胶回收即可。（如果担心有酶切不完全的质粒存在CIP不是很理想的话，可以在酶切后，将所有的酶切体积取出至一个新的离心管中，在加入CIP操作即可）
希望你能做好这个实验，希望对你有所帮助。

2008-04-24 09:52