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yangzhongduo

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176楼

to lian_zhen:
你的标书读了感觉没说出要解决的科学问题是什么,这个问题应该是一个你发现的或目前公认的在做这方面研究时存在的问题,而你可能针对这些问题提出新的解决办法,这样是不是更好呢,一点酌见.

2009-05-30 14:31

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yangzhongduo

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177楼

2009-05-30 14:37

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cmjtjmu

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178楼

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一、立项依据和目标
1. 本课题研究意义及同类研究工作国内外研究现状、知识产权状况与存在问题
人口老龄化成为一个全球性现象，在全世界186个国家和地区中，有1/3以上的国家和地区已进入“老年型”社会，中国的某些城市也已进入了“老年型”社会。据联合国估计，1950年，全世界60岁以上的老年人约有2亿，1970年达到3亿，2000年达到6亿。2020年将达到10亿，2050年，全球将有近20亿的老年人。目前世界绝大多数老年人口生活在亚洲3.38亿，中国60岁及以上老年人口1.34亿，占世界老年人口的21.34%，占亚洲老年人口的39.7%，2050年，亚洲老年人口将增长到12.27亿，中国老年人口将超过4亿，占全国总人口的30%，比目前法、德、意、日、英五国的总人口还要多。随着人口的老年化，老年人的相关问题将日渐突出，如老年人生活问题、医疗保健和社会保障问题，这些问题的有效处理直接关系到国民经济发展和社会稳定。
近年来多数调查结果显示，在欧美国家，60岁以上老年人6%~12%发生痴呆，85岁以上的老人则有20%~40%发生痴呆，其中半数以上为老年性痴呆。在全球约有超过2000万的人患有该病，痴呆发病率随着年龄的增长而成倍上升，年龄每增长5岁，发病率即增长一倍。在65岁以上的年龄段中，老年痴呆的发病率约为5%；超过85岁，发病率增加到25%；95岁以上的人群当中高达60%。我国流行病学资料表明：55岁以上老人痴呆症总患病率为2.9%，65岁以上人口中痴呆症总患病率为5.22%。其中，60-69岁人群中老年痴呆症的发病率为2.3%，70-79岁为3.97%，80岁以上为32%。我国现有65岁以上人口9610万，估算全国共有各类痴呆症患者500万，老年痴呆占2/3之多，2050年，痴呆患者将增加到2000万，与目前全球痴呆人数持平。这是中国未来几十年将面临的严峻问题，医务人员和相关专业人员对这个问题应引起高度的重视，在疾病的早期诊断和干预方面做些深入的研究。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年痴呆的最常见原因，它是一种原因不明的、进行性的、中枢神经系统的退行性疾病，其特征性病理改变为大脑皮层及脑区的纤维蛋白沉积,即细胞外间隙的β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)和细胞内多聚Tau蛋白的沉积,两者在病理形态学上分别表现为老年斑(SP)和神经纤维缠结(NFT)。AD患者的最终结局痴呆，当出现明显痴呆时，临床诊断没有多大困难，但此时病情已无法逆转，失去了治疗时机。最近有研究者提出从正常老年发展成AD痴呆是连续的过程，纽约大学医学院Barry Reisberg博士把这个连续过程分为七个期：Stage 1—正常增龄期（normal ageing），Stage 2—极轻微认知损害期（very mild cognitive impairment），Stage 3—轻微认知损害期（mild cognitive impairment），Stage 4—中度认知损害期（moderate cognitive impairment），Stage 5—中等严重认知损害期（moderately severe cognitive impairment），Stage 6—严重认知损害期（severe cognitive impairment）， Stage 7—极严重认知损害期（very severe cognitive impairment）。正常增龄期，其记忆能力与年龄和教育水平相对应，既无主观记忆减退的体验，也无客观的认知损害；极轻微认知损害期，个体有主观记忆减退的症状，如忘记熟悉的字或人名，或常找不到钥匙、眼镜或其它常用物品，朋友、家人或同事还没有注意到记忆问题，医学检查无异常发现，这些现象可能是增龄相关改变，也能是AD最早期的症状；轻微认知损害（MCI）期，有主观记忆困难，朋友、家人或同事能发现其记忆缺陷，医学检查或心理测试发现有记忆缺陷的证据，其它认知功能和社会功能没有明显的缺陷，有这些症状的老年人三年后有半数发展成AD，许多研究者把MCI看着临床前期AD；中度认知损害期，即临床早期AD，除记忆损害外，还有其它认知功能损害，如执行功能、推理能力和计算能力等方面的损害，IQ<70，社会适应能力受损；以后各期认知损害更加明显。Zaudig M认为从正常增龄到AD是一个连续谱，可以人为地分为几个期：正常增龄期、无症状AD期、主观记忆减退期、轻度认知损害期（轻、中、重）、AD痴呆期，如下图所示。
MCI和AD的关系虽然没有最后定论，但多数研究者认为MCI是正常老化与AD的过度期，Bozoki A等人研究发现每年有4%-25%的MCI发展成痴呆，但多数随访研究发现每年有10%-15%的MCI发展成痴呆，所以多数研究者把MCI看着临床前期AD。在无症状AD期，部分病人未经特殊治疗，可能会自发逆转；在主观记忆减退期和轻度认知损害期，经合理有效治疗，部分病人可能会逆转；进入痴呆期后，即使积极治疗，也无法使病情逆转，但能延缓疾病的进程。由此看来，AD的早期诊断对指导治疗和改变预后具有重要的意义，也是发展新治疗技术的基础。要改变AD患者的结局，必须在轻度认知损害期之前做出诊断，这才是真正意义上的AD早期诊断。
AD早期诊断标记包括神经心理学标记和生物学标记，后者包括遗传标记、影像学标记和神经生化标记。在神经心理学标记方面，主要是测量新联想形成和保持的记忆测验、反映执行功能的神经心理测验，因为与学习和记忆有关的神经细胞首先受损，以后逐渐波及到控制思维、判断和行为的神经细胞。在遗传标记方面，目前发现有四个基因与AD发病有关，其中三个基因（分别在1、14和21号染色体上）与早发AD有关，载脂蛋白Ｅ等位基因（APOE-4）与晚发AD有关。
在影象学标记方面，目前比较多研究认为SPECT和PET可以作为AD早期诊断技术，已发现早期AD患者存在颞顶区低灌流，而且血流降低程度与认知功能下降程度存在显著的相关关系；AD早期多巴胺系统的调节也值得关注，已发现海马、颞叶中D2受体变化与图片记忆、人名记忆等功能密切相关；FDG-PET显像显示中颞叶在AD早期存在糖代谢速率下降；近年来正在开发靶向斑块显像剂，以期待能在活体脑中直接标记显示AD的特征性病理改变——老年斑(SP)和神经纤维缠结(NFT)。联合应用多种显像剂进行活体脑显像，探讨AD机制，将是AD早期诊断中的重大突破。
在神经生化标记方面，主要是测量脑脊液和血液中Ａβ和Tau蛋白，目前认为在疾病早期随着年龄增加，Aß沉积增加，脑脊液中Aß1-42降低，但单纯检测脑脊液中Aß含量并不能作为AD的诊断指标。AD患者脑脊液中Tau蛋白含量增高，与其他神经系统疾病以及正常人之间有显著性差异。脑脊液中Tau蛋白检测对AD的诊断具有75%的特异性和93%的灵敏度。上述这些诊断技术在不同阶段的AD患者中诊断的特异性和敏感性，国内外都有研究报告，结果差距很大，从30%到90%，有些甚至出现矛盾的结果。从现有的研究文献来看，多数研究是对单一指标的考查，联合多项指标的研究不多；横断面或短期随访研究多，长期的随访研究少；多数研究的对象是临床期AD，对临床前期AD的诊断价值还不清楚。
AD早期诊断必须在轻度认知损害（MCI）期之前做出，在DSM-Ⅳ和ICD-10都列入了增龄相关认知损害的诊断类别，并提出了相应的诊断标准：年龄在50岁以上，有AD特征病理改变的物质基础，与年轻时相比记忆力有明显的减退，客观记忆测验成绩低于年轻成人平均成绩，一般认知功能和日常生活能力正常，没有痴呆的证据。多数调查发现，有1/3的老年人符合MCI的诊断标准。多数学者认为MCI是AD的早期，将来可能发展成AD痴呆，有研究报告每年有25%的MCI患者转化为痴呆，大多数研究报告每年有10%-15%的MCI患者发展成AD痴呆，因此及时诊断和治疗MCI对改变AD的结局具有重要的意义。
本项目拟以MCI为研究对象，采用纵向研究方法，考查神经心理测验、脑脊液/血浆Ａβ和Tau蛋白、神经核医学显像技术（Ａβ班块显像和D2受体显像）、载脂蛋白Ｅ等位基因（APOE-4）对早期AD的诊断特异性和敏感性，以及对AD痴呆的预测价值。靶向Ａβ班块显像技术在活体直接显示AD特征病理改变（老年斑）国内外还没有报道，有关多巴胺D2受体与AD的关系国内也未见报道。如能开展此项目，有望研制出一套客观、特异、灵敏的早期AD诊断技术，对AD预防、治疗和新药开发具有重要的指导意义，可望改变AD的结局，为家庭和社会做出积极的贡献。

主要参考文献
（1）Burns A, Zaudig M. Mild cognitive impairment in older people. Lancet, 2002; 360:1963-1965
（2）Albert MS. Cognitive and neurobiologic markers of early Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:13547-13551
（3）Mitchell A, Brindle N. CSF phosphorylated tau—does it constitute an accurate biological test for Alzheimer’s disease? International Journal of Geriatric Psychiatry, 2003, 18:407-411
（4）Nitsch RM, Rcacck GW, Deng M,et al. Cerchrospinal fluid levels of amyloid-ß protein in Alzheimer’s disease; Inverse correlation with severity of demcntia and effect of apolipo protein E genotype, Neurol,1995,87:512-518
（5）Encinas M, De Juan R, Marcos A, et al. Regional cerebral blood flow assessed with 99mTc-ECD SPET as a marker of progression of mild cognitive impairment to Alzheimer’s disease. Euro J Nucl Mol Imaging, 2003, 30:1473-1480
（6）Este´vez-Gonza´lez A, Kulisevsky J, Boltes A, et al. Rey verbal learning test is a useful tool for differential diagnosis in the preclinical phase of Alzheimer’s disease: comparison with mild cognitive impairment and normal aging. Int J Geriatr Psychiatry 2003; 18: 1021–1028
（7）Demattos RB, Bales KR, Cummins DJ, et al. Brain to plasma amyloid-ß efflux: A measure of brain amyloid burden in a mouse model of Alzheimer’s disease. Science, 2002, 295:2264-2267
（8）Kung MP, Catherine H, Zhuang ZP, et al. IMPY: An improved thioflavin-T derivative for in vivo labeling of ß –amyloid plaque. Brain Reseach, 2002, 956:202-210
（9）Skovronsky DM, Bin Z, Kung MP, et al. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology, 2000, 97:7609-7614
（10）王力，程灶火，李欢欢. Alzheimer病人记忆损害特征的研究。心理科学，2004年第4期
（11）Kemppainen N, Laine M, Laakso MP, et al. Hippocampal dopamine D2 receptors correlate with memory functions in Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 2003 Jul;18(1):149-54.
（12）Mega MS, Chu T, Mazziotta JC,et al. Mapping biochemistry to metabolism: FDG-PET and amyloid burden in Alzheimer's disease. Neuroreport.

2009-05-30 22:35

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cmjtjmu

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179楼

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国家自然科学基金资助项目( 30672161)
1. 项目的立项依据
垂体腺瘤是一种常见的颅内肿瘤，约占颅内肿瘤总发病率的10％－15%，垂体生长激素（growth hormone, GH）腺瘤是垂体腺瘤中一种特殊类型，生长快、侵袭性强，主要表现为GH分泌过多引起的内分泌异常症状，难于治疗[1]；多年来，对其发病机制和内分泌学的研究一直是GH腺瘤研究的重点。
正常垂体GH的分泌受生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）和生长抑素（Somatostatin, SS）双重调控。二者通过激活各自受体，调控腺苷酸环化酶活性，调节细胞内第二信使cAMP和蛋白激酶A（PKA）水平，促进或抑制生长激素分泌。以上二种调节途经称为GH分泌的经典调节途径。1989年，Landis CA等首先在欧洲发现约有40%的垂体GH腺瘤患者存在gsp癌基因。该癌基因可以刺激G蛋白和腺苷酸环化酶持续激活，导致cAMP异常增多，引起GH过度分泌[2]；生长抑素类似物对改善部分垂体GH腺瘤患者的临床症状有明显效果，但部分耐药病例也提示，人垂体GH腺瘤可能存在更为复杂的GH分泌调控机制。
近年来，另一调节人垂体GH的途径—“GHS/Ghrelin--GHS-R途径”被人们发现。生长激素释放剂受体（growth hormone secretagogue receptor, GHS-R）是一种由366个氨基酸组成的G蛋白偶联受体，通过与其配体GHS/Ghrelin结合参与脉冲性GH释放调节[3]。GHS-R在多种组织中均有表达，在神经系统中垂体前叶和下丘脑表达最高；在垂体腺瘤中生长激素（growth hormone, GH）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone, ACTH）腺瘤表达特异性增高。研究发现，GH腺瘤中，GHS-R mRNA表达高出正常垂体200倍[4]。该系统和经典的GHRH/SS调控途径不同，GHS-R是通过PLC-IP3/DAG-PKC双信号通路发挥作用，该信号通路对GHRH的促GH分泌有协同作用[5]，这种作用可能是导致人GH腺瘤对单一治疗药物产生耐药性的重要原因。
我们在对GH腺瘤中GHS-R信号传导的研究（国家自然科学基金资助课题，No.39670736）中发现，①国人的gsp癌基因表达为40%（和欧洲人种的发病率相同），无法解释其他60%的GH腺瘤的发病机制；GHS/Ghrelin--GHS-R途径则可能是对gsp癌基因理论的补充；②GHRH/SS下游的PKA通路和GHS-R下游的PKC通路对GH激素分泌及信号传导存在协同作用；③Ghrelin和GHS-R在人垂体GH腺瘤中特异性过度表达，可能通过自／旁分泌机制参与GH腺瘤生长及GH分泌的调控，可作为判断GH腺瘤侵袭性及预后标志之一。④垂体GH腺瘤中可能存在GHS-R所固有的负反馈机制——“脱敏”机制的减弱，且与肿瘤发病机制有关[6]。
前期研究中，发现PKA通路和PKC通路在GH腺瘤GH分泌及信号传导中存在协同作用；但两者间的信号传导机制尚不明确，在GH腺瘤中确定两者发生信号传导的下游分子，检测出其间作用的中间蛋白或非蛋白分子；不仅可通过深化GHS-R信号传导机制的研究扩大对GHS-R作用机制和GH腺瘤发病机制的认识，为垂体GH腺瘤的联合药物治疗提供理论依据；而且因普遍认为PKA通路作用于肿瘤的早期阶段，PKC通路和肿瘤的侵袭性有关，所以对研究非侵袭性和侵袭性肿瘤间的关系有一定意义。
在进一步的对GHS-R在GH腺瘤的作用机制研究中我们拟选择GHS-R基因启动子干预的方法。目的基因的启动子干预是当前研究肿瘤基因表达调控的一个新方向；确定该基因启动子关键的调节序列和与之结合的转录因子（transcription factor, TF）不仅是该领域研究的前提，而且对一些疾病的病因和发病机制的研究也有帮助。在此基础上设计的以转录因子为治疗靶点的分子化合物中，当前以TF decoy寡核苷酸（decoy-ODNs）策略较为优越和先进，通过靶向性竞争俘获活化的转录因子，从目的基因表达的调控区对启动子的活性进行调节，从而达到研究和体外实验性治疗的目的[7]。
初步对GHS-R启动子的研究表明，人GHS-R基因的5’-端侧翼区虽没有典型的TATA盒序列，但在-215－-237间存在其高度近似区。该区间上游有多个可能的转录因子结合位点，其中包括Pit-1、PEA-3等[8]。通过荧光素酶测定转染含有不同长度5’－端片段的大鼠GH3和GH4细胞中的启动子活性，发现了一些可能的正性调控区（enhancer region）和负性调控区（repressor region）；但缺乏在人类正常细胞和肿瘤细胞中的证实。
本项目拟采集临床标本，原代培养GH腺瘤细胞和垂体前叶细胞，采用对多种细胞内第二信使的分别激活或抑制手段，检测细胞内部的信号改变和垂体GH腺瘤的激素分泌和生长特性变化，确定PKA和PKC传导通路间发生信号传导的下游分子；自行构建来源于原代细胞的cDNA文库，运用改良的酵母双杂交系统和三杂交系统筛选和证实两者间作用的中间蛋白或其他小分子，并评估推论。同时，应用DNA迁移测定（DNA Mobility Shift assay）、DNA足迹技术（DNA footprinting）确定GHS-R基因启动子正性调控序列和相应的转录因子，通过decoy 策略抑制启动子活性，从而下调GHS-R的表达，进行通路活性和内分泌功能检测，进一步研究GHS-R在GH腺瘤中的作用机制；并对相应的TF验证、对比、综合、筛选，为以后的治疗研究提供参考和方法。
   本课题实施的意义在于：1. 以GH腺瘤为研究对象探索PKA和PKC通路间的相互作用； 2.丰富和深化GHS-R基因的转录调控理论；3.进一步探讨GHS-R的作用机制；4. 尝试针对GHS-R基因启动子的实验治疗研究。

参考文献
1. Asthagiri A, Lopes MB. Neuropathological considerations of pituitary adenomas. Front Horm Res, 2006, 34 : 206-235.
2.  Asa SL, Ezzat S. Genetics and proteomics of pituitary tumors. Endocrine, 2005, 28 (1) : 43-47.
3.  Simith RG. Development of growth hormone secretagogues. Endocr Rev, 2005, 26 (3) : 346-360.
4.  Volante M, Allia E, Gugliotta P, Funaro A, Broglio F, Deghenghi R, Muccioli G, Ghigo E, Papotti M. Expression of ghrelin and of the GH secretagogue receptor by pancreatic islet cells and related endocrine tumors. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87 (3) : 1300-1308.
5.  Kamegai J, Tamura H, Shimizu T, Ishii S, Tatsuguchi A, Sugihara H, Oikawa S, Kineman RD. The role of pituitary ghrelin in growth hormone (GH) secretion: GH-releasinghormone-dependent regulation of pituitary ghrelin gene expression and peptide content. Endocrinology, 2004, 145 (8) : 3731-3738.
6.  张华楸, 王雄伟, 范月超, 王和平, 叶飞, 雷霆. “交叉通讯”在人垂体生长激素腺瘤激素分泌中的调控作用研究. 微循环学杂志, 2005, 15 (2) : 11-14.
7.  Ahn JD, Kim CH, Magae J, Kim YH, Kim HJ, Park KK, Hong S, Park KG, Lee IK, Chang YC. E2F decoy oligodeoxynucleotides effectively inhibit growth of human tumor cells. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 310 (4) : 1048-1153.
8.  Yeung CM, Chan CB, Cheng CH. Isolation and characterization of the 5'-flanking region of the growth hormone secretagogue receptor gene from black seabream Acanthopagrus schlegeli. Mol Cell Endocrinol, 2004, 223 (1-2) : 5-15.

2009-06-08 20:31

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