【专题讨论】SDS-PAGE失败实例及分析[SDS-PAGE “hall of shame”] [精华]

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楼主

lee800265

肿瘤科

丁香园中级站友

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1楼

这个帖子发布于12年零56天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

SDS-PAGE是蛋白质及核酸分离中的常用技术，其质量的好坏往往对后续操作具有决定性的影响，这个专题也许并不能带给你完整的SDS-PAGE技术的理论体系，也不能告诉你怎样制备一块完美的凝胶，但是，它通过实例告诉你什么是错误的，我们应该怎样去改进，我想这往往是我们最需要的...
这个专题是一个译本，来自于Rice大学的网站，http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html，我看过很多遍，觉得非常有用，因此也就萌生了将此翻译为中文，供大家方便的浏览，鉴于本人的英语水平有限，译文中如有错误望各位战友不吝指出，谢谢！

我也非常希望能够借此帖引起大家对SDS-PAGE中的问题进行反思，共同讨论您在SDS-PAGE中遇到的问题及解决方案，争取在这里建立一个SDS-PAGE问题凝胶的图像库。

OK，let's go....

SDS-PAGE “hall of shame”
如果你能够非常熟练的制备一块完美的凝胶，甚至对它进行改进都十分困难，那么你真的应该值得庆幸！但是如果你不能达到这个水平也不要灰心。所有的优秀的科学家都是从失败中成长起来的，事实上，如果不出错我们就很难学到更多的东西！（我的western blot技术也是从上百次的失败中成熟起来的，这中间我就学到了很多，相对于PCR，我第一次就成功的做出了RT-PCR和重叠延伸PCR，但是对于PCR我能说的真的很少！）

这本“失误大全”包括了过去实验室中许多学生包括老师跑的最“烂”的胶，它们代表了人们在跑胶是最容易犯的多种错误（当然这些错误仍在更新之中）。看你自己的胶缺陷也许并不能很好的解决问题，至少不是最完美的解决方式，本文用图例指出你可能在哪一些方面改进你的技术。

评价你的胶找出你的症状并和这个小册子收集的实例比对。每一个例子都配有完整的凝胶图像和与之相对的解释及建议。从这本“失误大全”中你应该能够找到解决你的问题的正确的方法。

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2007-11-25 01:30 浏览 : 41332 回复 : 191

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jnuxz 编辑于 2008-06-03 15:52

• 博士上岸，年底感谢园子

楼主

lee800265

肿瘤科

丁香园中级站友

热

2楼

症状1——涂抹痕迹（smears）
涂抹痕迹——例1
涂抹痕迹可能由于多种原因引起，但是最常见的原因是聚丙烯酰胺凝胶倒胶的不均匀或者上样量过大。

这块胶倒胶不正确，在上部胶倒入制胶槽之前就已经发生聚合。首先倒入的胶聚合发生的太快了。与其重新倒胶，不如停止倒胶重新准备新的聚丙烯酰胺混合液，然后将新的胶倒入旧胶的上方。但是显然这种连接不是非常牢固。（我推荐重新倒胶，制胶很关键，如果你后续还要做blot，胶没有跑好浪费太多了！）

2007-11-25 01:36

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lee800265 编辑于 2007-11-25 02:32

• 丁香热议——兰州一医院挂号费全都降为1元，网友吵翻了

楼主

lee800265

肿瘤科

丁香园中级站友

3楼

涂抹痕迹——例2

这块胶每孔上样量过大。大多数的泳道还是能分清条带，但是在3、4道涂抹痕迹非常明显。这些泳道的样品主要含有一种蛋白（血红蛋白的亚基），与9、10道一样。但是，3、4道的样品低估了红细胞裂解物和红细胞胞浆组分中的蛋白含量。这些组分包含了过多的蛋白以至于样品需要稀释后才能进行蛋白含量测定。但是这名学生却忘记了这个样品已经稀释过了，因此造成了蛋白浓度的低估。（严重的失误啊！）
小型胶每孔的蛋白样品的量为20-40微克，取决于所需的分辨率和混合液中包含的多肽数目。但是，如果是一个纯化样品上样，一个带包含了20-40微克蛋白，那么其结果肯定也是一团糟！