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【专家讲座】GE公司於莉女士《定量蛋白质印迹实验的最优化方法》——已结束 [精华]

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楼主

20021108

丁香园荣誉超版

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1楼

这个帖子发布于13年零77天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

～～～热烈欢迎GE公司於莉女士光临蛋白版～～～

通过我版热心战友baiy引荐，我们有幸邀请到GE公司专门从事蛋白质科学研究的於莉女士光临蛋白版进行专题讲座。在此丁香园蛋白质技术讨论版全体版主代表蛋白版会员对于於莉女士的到来表示热烈的欢迎，并对於莉女士带给我们的精彩的讲座致以由衷的谢意。

本次讲座将开设两帖：
1. 本帖：於莉女士将在本帖进行讲座；广大战友可以在本帖跟贴提问。
2. 答疑贴：我们将定期收集整理战友提问统一开贴，於莉女士将定期对于所有提问一并解答。

本次讲座内容为“定量蛋白质印迹实验的最优化方法”。蛋白质印记实验长期以来一直困扰着从事基础研究的研究者，相信这次讲座将给与我们很大的帮助。这正是我们邀请於莉女士来此进行讲座答疑的初衷。
本次讲座视频链接： http://player.youku.com/player.php/sid/XOTcwODY3Mg==/v.swf

为了便于整理以及对讲座人员的尊重，请提问战友尽量遵守以下格式进行提问：
提问格式如下：
於莉女士您好，我是丁香园会员***，我对于您的这次讲座很感兴趣。我的问题是：……

欢迎鼓励广大战友提问，对于选中的有意义的提问，我们将进行1分的积分鼓励。

最后，再次感谢於莉女士在百忙之中热心关注蛋白版，谨代表蛋白版祝於莉女士身体健康，幸福美满。

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2007-11-05 00:16 浏览 : 15571 回复 : 59

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20021108 编辑于 2007-12-16 11:18

• 「考研树洞」第一弹：大龄考研你怎么看？你身边有大龄考研的吗？

楼主

20021108

丁香园荣誉超版

2楼

特别感谢GE Healthcare Life Sciences China 市场传讯部经理王絮语女士对本次活动的大力支持和因此付出的辛勤劳动！

报告人介绍：
於莉
GE Healthcare Life Sciences中国公司产品专家，主要负责蛋白质组科学相关的所有产品的技术支持。在蛋白质荧光差异分析技术，蛋白质的检测和成像方面有丰富的经验。

Jennifer Fox
GE Healthcare Life Sciences的应用产品专家，主要负责对全球的和蛋白检测成像系统相关的技术支持。她的专长涉及从常规的蛋白印迹到蛋白差异的荧光定量分析的所有和蛋白检测与成像相关的领域，此次专题的内容就是她在此类研究方面的经验的分享。

GE Healthcare Life Sciences 关于本次讲座的链接：
https://event.on24.com/eventRegistration/EventLobbyServlet?target=registration.jsp&eventid=52462&sessionid=1&key=1CB7EDC759B970A463E6E00E0F5C241B&sourcepage=register

2007-11-05 00:16

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20021108 编辑于 2007-11-05 00:33

• 首张“新冠患者分子全景图”

ettandige

铁杆站友

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3楼

1.本次讲座的题目是定量蛋白质印迹实验的最优化方法.

2.开始前想问一下，我们为什么要作蛋白质印迹实验？
一些研究人员可以通过这个实验研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在在样品当中，或者是为了了解蛋白质的分子大小，分子越迁，或分子量的改变。另外一些人作蛋白质分子印迹实验则更关心蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。这时候，蛋白质的精确性就变得非常重要了。无论你多关心蛋白质的印迹方法，最终都会落实到如何进行精确的定量。

3.在大多数情况下，我们都会选择以下几种方法来检测目的信号。比色法、同位素检测或者是化学发光方法或荧光检测。其中，化学发光检测是目前使用最多的方法。通常是在胶片上曝光化学发光信号。化学发光的方法虽然是非常灵敏的，可是胶片对发光信号的检测动态范围却非常有限，从而导致不能非常精确的定量蛋白质的表达。今天我们要谈的主要议题是，可以取代传统的化学发光技术的荧光检测技术。因为它可以更好的对目的蛋白进行精确的定量。

4.在下面的图表中有各种蛋白质印迹技术和相应的使用试剂。在蛋白印迹实验中，最先使用的是初级抗体，它首先和目的抗原发生特异性的结合，然后再将二抗偶联上，接下来有两种方式可以进行检测，也是我们前面提到过的。一种是直接检测法，它是直接检测二抗上偶联的荧光分子；另一种就是间接检测法，其二抗上偶联的是HRP，也就是我们常见的辣根过氧化物酶，或AP—碱性磷酸酶分子。然后加入其作用的底物检测目的信号。向我们常见的ECL Plus，其底物既可以化学发光，也可以荧光检测。

5.接下来看一下化学发光样品在蛋白质印迹试验中的具体流程。首先是要把蛋白质从胶上转移到膜上进行检测。现在使用的膜通常是NC膜、硝酸纤维素膜或PVDF膜。然后进行一抗的孵育，使其特异性的结合于目的抗原，再进行有HRP的二抗孵育，使二抗和一抗结合，最后加入HRP的ECL底物，反应生成的化学信号可以通过胶片曝光获取，也可以通过凝胶成像系统捕获。通常，这种信号最多能够维持20分钟，或在20分钟后淬灭。

6.前面我们已经谈论了一些传统的化学发光方法，那么究竟定量蛋白质印迹方法比传统的化学发光蛋白质印迹方法有哪些优势呢？首先就是动态范围的问题：
有更宽的动态范围就能够检测到更宽的蛋白表达范围，而传统的胶片检测方法只有非常有限的动态检测范围，所以在曝光时间过长的情况下很容易出现信号过饱和，就会导致无法有效定量。
除了动态范围，另一个就是灵敏度的问题，灵敏度越高就可以检测到更低
表达量的蛋白信号。
最后是信号的稳定性，即信号可维持时间的长短，这些对定量都是非常重要的因素。

7.下面我们将介绍化学荧光和化学发光法之间的比较。

8.首先，介绍一下原理。
我们称之为间接的化学发光蛋白质印记试验，会发现它非常类似传统的ECL化学发光反应。它是将一抗特异性的结合于固定在膜上的固定抗原，再将偶联有HRP的二抗与一抗结合，最后加入ECL plus底物与HRP发生化学反应，其中产生的化学发光信号可以在胶片上曝光获取，或者在CCD凝胶成像系统上捕获。另外它还可以生成化学荧光信号，其信号可以稳定的存在于膜上，所以可以在任何时候，甚至可以在几小时后，都可以在膜上直接检测到荧光信号。其荧光信号的激发波长在457nm。该激发的信号可以被很好的定量。因为它比化学荧光信号有更宽的动态范围。

9.在下面的例子里，可以看出样品在化学发光曝光五分钟之后的结果和化学荧光的一个比较。在这个结果中可以看出定量上非常大的差别。在化学发光的结果里，有些条带明显的过饱和了，那是因为曝光时间对高丰度信号过长了，只有缩短曝光时间才能对高丰度蛋白进行有效的定量。同样的样品拿到荧光成像系统，获取化学荧光信号，从结果上看，可以精确的定量高丰度蛋白。所以在化学发光定量图上，部分信号值是非线性的。而在化学荧光定量图上维持了非常好的线性关系。

10.那么化学荧光ECL plus的优势究竟有哪些呢？
第一：多功能性和信号稳定性；ECL plus既可以化学发光，也可以做化学荧光。其化学发光的信号比传统的ECL持续时间更长，可以达到24-48h。而它的化学荧光信号在膜上持续的时间可以超过48小时。
第二：相对于定量来说，化学荧光有更宽的动态范围。所以更多的检测到不同表达强度的信号，能够更精确的区分微小的差异变化。
第三：更高的灵敏度。所以可以检测到更低表达丰度的蛋白质。
第四：因为是荧光成像系统直接成像，不像传统的胶片曝光，由于动态范围窄的局限性，需要在胶片上一次次的曝光优化结果。荧光成像只要在电脑上设置相应的参数和分辨率就可以直接获取结果，非常简便，直观的获取到最佳结果。

11.接下来，介绍一下直接荧光检测的应用。

12.首先是原理介绍，在这副图上。可以看到目的蛋白用直接荧光蛋白质印迹试验来检测。蛋白仍然是从胶上转移到膜上。膜是低荧光的PVDF膜，但要注意的是，膜上检测的是来自于样品的两个目的抗原。这两个目的抗原都将通过直接荧光蛋白质印迹试验同时被检测到。所以要将两个特异性的一抗和样本中所需要检测的目的抗原进行特异性的反应。然后再将带有荧光基团的二抗结合到一抗上。和前面提到的间接检测法相比，不再需要内部的底物反应了。而且偶联在二抗上的荧光分子非常稳定，通常可以保存三个月以上。每个二抗上的荧光分子通过每次的激光发射，在成像系统上捕获膜上的信号就可以知道目的信号的强弱。

13.为什么选择做直接荧光蛋白质印迹试验？
首先，它的定量范围大大的增加了。在非常灵敏的检测到底丰度蛋白的同时，还能够有效的定量检测到高丰度表达蛋白。另一个直接荧光定量检测的优势在于，可以同时检测到两个目的抗原，将未知的蛋白和看家蛋白进行归一化校正，得出更加可靠的定量结果。如ECL plex试剂盒。
其次，它有最高的灵敏度，可以检测到更低的表达丰度蛋白。最后它的操作非常简便，不需要象传统的方法进行探针的剥离和再杂交。节约时间，可以在电脑上直接设置分辨率和各种参数，进行数字化成像，同时可以减少膜的使用量，其信号非常稳定，可以超过三个月的维持时间。最重要的是它可以进行多重检测，即可以同时检测到两个目的抗原，这对相对定量来说是非常重要的。

14.这是一个非常好的例子来说明这种多重检测的方法。从图上可以看到红色的目的条带是磷酸化的Akt蛋白，绿色的是β-tubulin内参蛋白，我们可以清楚的看到，磷酸化的pAkt蛋白的表达量随着时间的变化。使用的一抗是兔多克隆α-磷酸Akt抗体和鼠单克隆α-β-tubulin抗体。二抗使用的是ECL plex goat-α-rabbit IgG-Cy5和ECL plex goat-α-mouse IgG-Cy3。使用的封闭液和膜都兼容Cy3和Cy5荧光试剂。Cy5精确定量磷酸化的Akt蛋白，Cy3精确定量tubulin内参蛋白。

15.第二个例子是检测低丰度的磷酸化蛋白。在这个例子里我们可以看到pp38的表达量随着TGF-β刺激时间的增加而升高。在这里Actin Cy3标记的抗体检测到内参蛋白，对pp38的定量起到了非常重要的归一化校正。从而获得更为精确的结果！

16.相对看家蛋白的校正定量的重要性首先它消除了每个通道上相同的样品量的不确定性和误差，有时候我们在上样的时候会发生样品丢失，样品中的看家蛋白就可以起到归一化校正，从而可以精确的定量目的蛋白；
第二，它消除了膜上探针的剥离和再杂交的不确定性。因为在剥离和再杂交的过程中，会丢失掉许多蛋白的信息，这往往是非常难以控制的；
第三，可以更精确定量总蛋白里的磷酸化蛋白，如非磷酸化蛋白和磷酸化蛋白的比较。

17.在下面的这个例子里，可以说明了相对看家蛋白的归一化校正的重要性，我们可以看到ERK1/2 Cy5标记的蛋白在不同量的FGF-2的刺激下，在不同时间点，表达量变化的趋势，作为定量对照的GAPDH内参蛋白（绿色条带），理论上，其含量应该是不变一致的。但是我们们可以看到在第4、6、8通道上看到的绿色信号明显是和其他通道上的绿色信号的强度是不一致的。再看图表B，是未校正的ERK1/2蛋白表达的信号丰度图。图表C是ERK1/2与GAPDH的比值，现在能清楚的看到经过归一化校正之后得出的真正的定量关系。更真实的反映了ERK1/2蛋白在不同量的FGF-2的刺激下，其表达量究竟随着刺激时间的不同而发生了什么样的变化。

18.下面这个例子也很好的说明了低丰度磷酸化蛋白的表达差异性。该数据是由瑞典的Ludwig肿瘤研究所提供。在这个例子里面我们可以看出，Akt蛋白是由Cy5标记，磷酸化的蛋白pAkt是由Cy3标记。
显示蛋白表达的差异性，在彩色的图像上，可以看到pAkt和Akt重叠的条带，在TGF-β刺激下，随着时间变化的趋势。在下面的黑白图上，可以看到有多少信号是来自Cy3标记的pAkt蛋白，有多少信号是来自Cy5标记的Akt蛋白，同时还能看到各自表达量在TGF-β刺激下随着时间的变化趋势。最后还可以看出在加入1Y抑制剂之后，30min之后完全消除了磷酸化Akt蛋白的形式。

19.最后我们还将看到一个2D的多重蛋白质印迹试验的实例。
就是将跑完2D的胶直接进行蛋白质印迹试验。请看右下方有关这个应用文献的产品号。如果大家感兴趣可以在网上检索具体的操作的步骤和试验原理。

20.前面已经讨论了许多关于ECL plus和ECL plex的化学发光和化学荧光，以及荧光的单个及多重蛋白质印迹试验，检测的类型也有直接的方法或者间接的方法，以及各自的动态范围等各种个性。在下面这个表格里有更加详细的一个归纳。我们可以看到ECL plex的动态范围达到了3.6个数量级，ECL plus是2.1个数量级；而检测的灵敏度ECL plex是1.2 pg，而ECL plus是4.9 pg。

21.另一个很重要，并需要确定的是成像系统，以及可以选用的蛋白质印迹试验的试剂盒。选择了荧光系统就可以进行蛋白质定量分析及计算。现在可以选择的荧光成像系统，比如说，Typhoo Imager，或者说Ettan DIGE imager,以及 Storm imager。

22.为了更准确的去选择正确的成像系统，我们就必须首先知道该系统有相对应的荧光分子有相应的激发和发射光谱。
通常在市场上购买的荧光试剂都会说明该荧光分子的激发和发射光谱，成像系统上的光源要接近荧光分子的激发波长，同时成像系统上要配有相应的发射滤光片，可以过滤出荧光的发射光谱；还需要足够宽的动态范围来支持信号自身的动态范围，而且成像系统的动态范围要高于信号自身的动态范围。
其他的还要注意其灵敏度，要高灵敏度；低噪音背景；良好的分辨率；这些都能够帮助检测到不同表达量的目的蛋白。

23.在下面这副图里面可以看到，针对多重荧光蛋白质印迹试验所选用的发射激发光谱。我们可以看到Cy2、Cy3、Cy5的发射激发波长分别为488 nm,532 nm,633 nm。其发射光谱范围分布在520 Bp 40，580 Bp 30，670 Bp 30 之间。要注意的是它选择的滤光片都是Bp的滤光片，***滤光片，***滤光片能有效的过滤目的信号，减少干扰信号的存在。

24.选择成像系统的另一个重要的指标是动态范围。足够宽的动态范围才能够保证在一副图像上同时检测到高丰度蛋白和低丰度蛋白，而传统的胶片由于其有限的检测范围，很容易对高丰度蛋白产生过饱和的信号。

25.高灵敏度也是一个非常重要的指标。在这里指的是可以检测到极低丰度的蛋白质，或者是图像上扣除了背景的信号强度，或者是检测的极限。
对于可以真实的定量的另一个重要因素就是取得漂亮的线性信号结果。这些都是对高灵敏度的一个详细的描述。

26.分析荧光蛋白质印迹或者是普通蛋白质印迹试验所需要的分析软件。在任何批次运行的试验下，软件都必须给出定量的，可靠的定量结果。
在下面的例子里可以看出使用IQTL软件分析多重蛋白质印迹试验的结果。该软件可以回答很多有意义的问题，它能区分去来自Cy3和Cy5的信号量。所有这些可靠的信号都可以进行精确的比较。所有的试验分析数据结果都可以输出到Excel文档中。

27.在图中的的这个表格中，我们可以看到，它包含了每个通道蛋白原始的Value值，以及相对看家蛋白进行归一化处理之后的校正Value值。体现出了更精确的定量结果。

28.最后来介绍一下做荧光多重蛋白质印迹实验的操作要点和小技巧。

29.在进行蛋白质印迹实验时，往往会遇到一些难题，其中最重要的就是往往花了很多的时间来优化抗体的浓度。一开始有些研究人员加了太多的一抗和二抗，这就会导致非特异性结合，这种非特异性结合就会产生大量的荧光信号，就要严重干扰目的样品的真实信号，所以取得合适的一抗和二抗浓度稀释比例才能有效的减少非特异性结合，才能有效的节约后期的操作时间。

30.接下来要注意的是，多重荧光蛋白质印迹实验中应避免的一些操作。在操作荧光时要注意，有些物质在杂交前不能使用，比如考马斯亮蓝；有时工作人员会将膜放在有考马斯亮蓝残余的染色盘中，或者是残有溴酚蓝前沿，这些都会导致在成像时产生假阳性信号，会掩盖掉样品真是的信号定量。同样还要注意的是聚丙烯酰胺胶的碎片残留，也要完全被去除掉。
有些研究人员在操作膜的时候，要对膜进行标记，要避免使用圆珠笔，因为圆珠笔的黑色印渍会留在膜上，成像产生伪信号，也会影响到信号的定量。
其他要注意的是，有些化学物质要避免使用，比如说triton x-100。手套上的粉末或者脏的镊子也会在膜上留下干扰信号，这都是要避免的一些实验操作。

31.下面我们来看一下具体的操作图片。
这一幅图片，我们可以看到要避免考马斯亮蓝的操作，因为我们都知道，实验室经常有一些染色盘会进行考染或硝酸银染色，这些染色盘上由于没有完全清洁干净，会残留有考马斯亮蓝，这些残余的试剂很有可能粘附在膜上，在荧光成像的时候就会产生一些伪信号，错误的假阳性信号。

32.在下面这两幅图里面，我们可以看到的操作是：去除胶上面的上样孔和溴酚蓝前沿，这些操作都有助于我们看到真是的目的信号。

33.下面这些操作是要避免一些对膜的污染和错误性的操作。因为往往成像系统是非常灵敏的。它会记录下来任何在膜上的污染物质的信号，所以在操作时要尽量避免污染。在操作膜时，一定要使用平头、光滑的镊子，不要使用尖头的镊子，因为尖的镊子会在膜上留下印子，影响到真实蛋白的表达定量，另外要注意的是不要用手直接去接触膜，因为手上的油脂会留在膜上。避免用圆珠笔标记膜，改用对膜切角或用铅笔标记。

34.我们还要注意的是，在荧光蛋白质印迹试验中，最好使用低荧光背景的膜，因为有更低的背景值，就能得到更高的信噪比。所以更重要的是要看到更低表达丰度的蛋白质，所以在任何时候，做蛋白质荧光印迹实验，都要使用低荧光膜，我们在这里推荐Hybood LPF(低荧光PVDF)膜。

35.在扫描成像时，可以对湿膜进行扫描，也可以对干膜进行扫描。但是为了获得更低的背景，推荐使用干膜成像。在干燥膜时要注意使膜完全的干燥，如果膜的一部分仍然是湿的，就会产生不同的背景强度，只有完全干燥的膜才能获得最佳的信噪比结果。还要注意要将膜上有蛋白的那一面放在扫描平台上进行成像。

36.最后要注意的是扫描成像。无论将膜放在成像盒或扫描平台上成像时，都要保证使成像盒和扫描平台完全清洁干净。所以每次在扫描前，都要用70%的酒精清洗成像区域，才能将一些可能的污染物质清洗掉，不会导致信号的损失。还值得一提的是扫描是要在膜上压上一张低荧光板或重压物，防止干膜在扫描成像时移动导致信号错位。