【求助】ELISA中碰到的问题

请教各位：
今天做了ELISA，是测抗体的，做出来之后，阴性孔的后几个孔和空白对照组也显色了，而且测出来的OD值没有规律，有几个相同稀释倍数的孔和副孔OD值相差也大，分析了一下，觉得可能有几个问题。
1）要么是脱脂奶粉的封闭时间不够，我封闭了一个小时
2）用PBST洗板的时候，甩的方向不对，造成了孔之间的污染
3）二抗没洗涤干净，我用PBST洗涤了五次，每次间隔三分钟，要是再洗不干净我也不知道怎么做了
请有经验的朋友指教下。