请教双酶切与连接反应问题？

我做真核表达的，用pPIC9表达质粒，以EcoR I和Avr II两限制性内切酶作为酶切位点。目的片段和质粒后经Biolabs 公司的酶进行双酶切后，连接，转化JM109，倒平板。但就是不出现阳性克隆。我已经重复做了两个月了，就是不出结果。请高手们对于双酶切和连接反应给予指导。