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【求助】 重叠延伸PCR把我整跨了

最后编辑于 2005-10-27 · IP 上海上海
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这个帖子发布于 19 年零 351 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近作了好长时间重叠延伸PCR都没有成功,好痛苦,请求各位高手施救,万分感谢!
首先帮忙看看图中,我引物思路对否?重叠18个。

第二,我按以下二步进行扩增:
PCR1:
胶回收片断产物1(500bp左右) 20ng
胶回收片断产物2(500bp左右)20ng
buffer, dNTP, PFU, 95°C 30s/52°C 60s/72°C 60s,10个循环

PCR2
PCR1反应液4微升
引物1(20pmol)
引物4 (20pmol)
buffer,dNTP, PFU, 95°C 30s/55-68梯度°C 30s/72°C 120s, 30个循环

结果各温度(55,59, 63,65,68)均只扩出2原先片断本身大小条带(500bp) 。

请各位高手务必伸出援手,帮忙诊断,提出宝贵建议,万分感激。如果是上海市,可否告诉联系方式,想登门求助。
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