【求助】 重叠延伸PCR把我整跨了
首先帮忙看看图中,我引物思路对否?重叠18个。
第二,我按以下二步进行扩增:
PCR1:
胶回收片断产物1(500bp左右) 20ng
胶回收片断产物2(500bp左右)20ng
buffer, dNTP, PFU, 95°C 30s/52°C 60s/72°C 60s,10个循环
PCR2
PCR1反应液4微升
引物1(20pmol)
引物4 (20pmol)
buffer,dNTP, PFU, 95°C 30s/55-68梯度°C 30s/72°C 120s, 30个循环
结果各温度(55,59, 63,65,68)均只扩出2原先片断本身大小条带(500bp) 。
请各位高手务必伸出援手,帮忙诊断,提出宝贵建议,万分感激。如果是上海市,可否告诉联系方式,想登门求助。
