脱细胞基质与血管内皮细胞的体外相容性的试验
发布于 2003-10-18 · 浏览 1738 · IP 黑龙江黑龙江
这个帖子发布于 21 年零 200 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本文已于2003年发表在《中国修复重建外科杂志》第一作者，请大家多多指教。
脱细胞基质与血管内皮细胞的体外相容性的试验
【摘要】目的 将猪血管内皮细胞和异体猪血管脱细胞基质相结合，开发一种制备血管移植物的新方法。方法 分别利用0.1%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸钠(EDTA)和1.0%Triton X-100对猪主动脉作用24h和176h进行脱细胞。异体猪内皮细胞分离出来并进行体外细胞扩增，再将脱细胞的血管内表面种植上内皮细胞。通过光镜和扫描电镜检验脱细胞血管基质是否存在细胞成分和内皮细胞是否生长其上。结果 酶-化学除垢剂的脱细胞方法几乎使细胞完全脱落，且基质纤维的三维结构变得疏松。体外扩增的异体猪内皮细胞可以种植在脱细胞基质上并且具有伸展和增殖功能。结论 TritonX-100和胰蛋白酶制备的脱细胞基质与异体猪细胞具有良好的生物相容性，能结合到一起并在体外生成血管移植物。
【关键词】组织工程，血管移植物，细胞外基质，内皮细胞，种植
The experimental study of compatibility between acelluarized allogenic matrix and endothelial cell in vitro.
【Abstract 】：Objective：To develop a new method for a tissue engineered vascular graft combining endothelial cells and an acelluarized allogenic matrix. Methods: acellularized matrix tubes were obtained by a 0.1% trypsin and 0.02% EDTA solution for 24hr and 1% Triton X-100 for 176hr. Endothelial cells were isolated in parallel from alloaorta and expanded in vitro. Finally，the inner surface of acellularized matrix was reseeded with endothelial cells. Light microscopy and scanning electron microscopy performed analysis of acellularity and reseeding. Results: the acellularization procedure resulted in an almost complete removal of the original cells while the three-dimensional (3D) matrix was loosened. The acellular matrix could be reseeded with expanded endothelial cells in vitro, and endothelial cells had the potential of spread and proliferation. Conclusions: acellular matrix produced by Triton X-100 and trypsin possessed satisfactory biocompatibility for allogenic endothelial cell. Vascular grafts can be generated in vitro of endothelial cells and allogenic acelluarized matrix.
Key words: tissue engineering, vascular graft, cell matrix, endothelial cell, cell seeding
血管疾病是我国目前死亡率最高疾病之一，血管移植是其主要的外科治疗手段。目前临床最常应用血管替代物为自体大隐静脉，其中短期效果尚可。但由于血液动力学等因素的改变而易发生血管内膜增生、管壁纤维化和血管瘤等，因此不能满足永久替代的要求而往往需要再次手术[1]。涤纶(Dacron)等人工材料，可部分模拟人体血管的某些功能，但与自身血管相比弹性系数低、顺应性差及组织相容性差，可引起机体不同程度的免疫排斥反应。我们的试验应用胰蛋白酶和TritonX-100对猪主动脉进行处理，并以此为支架材料种植异体猪内皮细胞，构建新型的组织工程血管。为探索血管移植物的来源提供了一条新的思路。
1材料和方法
1．1材料和试剂
于屠宰场获取80~100kg家猪主动脉。TritonX-100，Ⅱ型胶原酶（Sigma）；内皮细胞生长因子（endothelial cell growth factor，bovine，bECGF）（Roche）；Hank's平衡盐溶液，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS），胰蛋白酶（1：250），EDTA，胎牛血清（fatal bovine serum，FBS），M199培养基，L-谷氨酰胺（Gibico）
1．2方法
1．2．1猪主动脉脱细胞的制备 获取猪的胸主动脉两根后，即将之保存在4℃ D-Hanks'平衡盐溶液中。热缺血时间少于10分钟。剥去其中一根血管外膜，将血管浸入1%新洁尔灭溶液中浸泡30分钟消毒。PBS冲洗若干遍，去除血管表面的新洁尔灭。然后将血管置于50ml离心管中，在37℃、5%co2的环境下，0.1%胰蛋白酶+0.02%EDTA作用24小时。之后，再用1%的Triton X-100溶液中26℃~28℃水浴振荡176小时。再将血管用PBS液反复冲洗几次以祛除残余物质，保存在4℃含Ca2+、Mg2+的Hank's 溶液中，并取材作HE染色和扫描电镜。
1．2．2细胞的提取和扩增 用含有青、链霉素（100U/ml）的D-Hanks'平衡盐溶液浸泡另一根猪主动脉10分钟后，剥去血管外膜，将其剪成2cm×2cm的组织块。组织块内膜面朝下浸于用0.1%II型胶原酶中，胶原酶仅浸没过内膜面。在37℃、5%co2孵箱中消化15~20分钟。用含10%FBS的M199培养液终止消化。收集消化液，1000r/min离心5分钟。弃上清，D-Hanks反复洗涤沉淀细胞两遍。用M199培养液制成细胞悬液，其中含10%FBS，0.15%ECGF，L-谷氨酰胺300μg/ml。调节细胞密度为5×105/cm2。置入50ml培养瓶中37℃、5%co2孵箱中培养。每2~3天换液一次。用0.25%胰酶和0.02%EDTA（PBS为溶剂）传代培养。取第2~5代内皮细胞用于种植和透射电镜检查。
1．2．3材料的处理和细胞的种植 将脱细胞的猪主动脉在无菌条件下剪成直径为1.5cm的组织块5块，置于24孔培养板中（内膜面朝上）紫外线灯下干燥24小时，使其微干。再滴入1~2滴胎牛血清，置于37℃、5%co2孵箱中孵育1~2小时。将内皮细胞用0.25%胰酶和0.02%EDTA常温下作用2~3分钟，见细胞变圆，间隙增大，轻微晃动培养瓶见有细胞已悬浮，即可用含10%FBS的M199培养液终止消化。1000r/min离心5分钟后，用D-Hanks反复洗涤细胞沉淀物两遍。用M199培养液制成细胞悬液，其中含10%FBS、0.15%VEGF，L-谷氨酰胺300μg/ml。调节细胞密度5×106/cm2，种植于预先放有脱细胞基质的24孔培养板中，置于37℃、5%co2孵箱中培养。12小时换液一次，于种植后16小时取材作HE染色和扫描电镜。
2结果
2．1内皮细胞培养情况 2~5代内皮细胞生长状况良好，内皮细胞呈扁平的短梭形或多角形，大小均匀，核仁清晰。细胞单层呈典型的铺路石样镶嵌排列生长（图1、2）。透射电镜检测可见典型的内皮细胞特征性细胞器W-P小体，其纵切面内有平行的细管包埋在高密度的基质中（图3）。表明培养的细胞为内皮细胞。
2．2组织学检查
2．2．1种植前脱细胞血管基质 （n=8）未见紫染核物质和细胞碎片残留，但可见弹力纤维排列规整。脱细胞血管基质已完全无细胞成分存在（图4）。
2．2．2种植内皮细胞后脱细胞血管基质：(n=8)内膜面可见有不连续蓝紫染的细胞存在。其余部分无核物质和细胞碎片残留。内皮细胞已经种植在脱细胞基质上(图5)。
2．3扫描电镜
种植前脱细胞血管基质的内皮细胞层被全部祛除，细胞外基质纤维粗细不等相互交织排列呈现1~10μm的微孔（图6）。种植内皮细胞后脱细胞血管基质可见发育良好的内皮细胞成群的分布于移植物表面，多呈圆形和椭圆形，有的黏附成团，有的紧密相接。细胞表面有丰富的球状突起。表明内皮细胞已种植在脱细胞基质上并且具有铺展和生长的能力（图7）。
3讨论
国内外已有用聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）等合成生物高分子为支架构筑组织工程血管的报道，但PGA等合成生物高分子的降解速率及力学性能还不能完全与生理状态血管相匹配[2、3]。我们应用韩雪峰等[4]制备脱细胞基质的方法制备组织工程血管支架。该支架由大量的可溶性胶原、弹性蛋白及氨基葡聚糖等大分子构成的复杂聚合体，与正常细胞外基质成分相似，其降解速度与细胞外基质生成速度相一致。Scott等[5]研究证明胶原和弹性蛋白等大分子在主动脉壁和主动脉瓣的相互关系对保持血管生物力学性质起关键作用。Meredith等[6、7、8、9]还分别证实细胞外基质对细胞代谢、功能、相互作用以及黏附有着重要作用。同时，由于异体细胞被清除，从而减小了脱细胞基质所引起免疫反应的可能。我们的光镜和扫描电镜检测也表明，制备的脱细胞基质保存了完整的弹力纤维和胶原等维持血管弹性的物质，其弹性良好，力学性能与正常血管相似，可防止动脉瘤的发生和血管壁的硬化。
我们在种植内皮细胞之前，用含有Ca2+、Mg2+的 Hank's保存脱细胞基质，是因为Ca2+、Mg2+对组织内部细胞之间黏附和细胞间结合的稳定性有重要作用，是细胞外液重要的离子。此外，用胎牛血清浸泡脱细胞基质有很多优点：①可提供内皮细胞在脱细胞基表面黏附和铺展的生长基质成分；②提供载体蛋白，可结合维生素和金属离子等；③中和残存的胰蛋白酶和TritonX-100的细胞毒性。用胎牛血清浸泡可能是脱细胞基质内皮细胞化最有利的机制之一。扫描电镜观察也表明，只要经过适当的处理，内皮细胞和异体脱细胞基质细胞均具有良好的生物相容性，使内皮细胞保持铺展和增殖的能力。
经过长期探索，人们已认识到内皮细胞是保持血管稳定性的天然调节物[10]。在血管损伤后，血管内皮细胞单层具有抗血栓形成和平滑肌细胞增生的作用，并且已在人和动物血管移植物模型中显示出有提高血管通畅率的能力[11、12]。因此，异体脱细胞基质的内皮化能够提高组织工程血管通畅率。但生理状态下血管内皮细胞与平滑肌细胞之间在形态结构和功能等方面相互影响，两细胞间的相互调节和影响是稳定血管壁结构的关键。同时体外静态培养与体内血液动力学环境下的内皮细胞在功能和形态方面存在着巨大的差异。因此，将来可通过生物反应器制备管形的组织工程血管，在体内实验中对内皮细胞和平滑肌细胞联合种植的脱细胞血管功能进行评价。
4参考文献
[1] Lawrie GM, Morris GCJr, Earle N. Long-time results of coronary bypass surgery. Analysis of 1698 patients followed 15 to 20 years. Ann Surg, 1991; 213:377.
[2] Niklason LE, Gao J, Abbott WM, et al. Functional arteries grown in vitro [see comments]. Science, 1999; 284(5413): 489.
[3] 熊 猛,艾玉峰,王 飏等. 采用组织工程方法体外构建血管模型的初步实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2001; 15(2): 109.
[4] 韩雪峰,杨大平,郭铁芳. 曲拉通X-100对制备猪胸主动脉脱细胞血管基影响. 中华外科杂志, 2002; 40(1):27.
[5] Scott M, Vesely I. Aortic valves cusp microstructure: the role of elastin. Ann Thorac Sury, 1995; 60: 391.
[6] Meredith JEJr, Fazeli B, Schwartz MA. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell, 1993; 4:953.
[7] Thoumine O, Nerem RM, Girard PR. Oscillatory shear stress and hydrostatic pressure modulate cell-matrix attachment proteins in cultured endothelial cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1995; 31:45.
[8] Lee RT, Berditchevski F, Cheng GC, et al. Integrin-mediated collagen matrix reorganization by cultured human vascular smooth muscle cells. Circ Res, 1995; 76(2): 209.
[9] Walluscheck KP, Steinhoff G, Haverich A. Endothelial cell seeding of native vascular surfaces. Eur J Vasc Endovasc Surg, 1996; 11(3): 290.
[10] Cines DB, Pollak ES, Buck CA, et al. Endothelial cells in physiology and in pathophysiology of vascular disorders. Blood, 1998; 91:3527.
[11] Deutsch M, Meinhart J, Vesely M, et al. In vitro endothelialization of expanded polytetrafluorothylene grafts: A clinical case report after 41 months of implantation. J.Vasc.Surg, 1997; 25:757.
[12] Pasic M, Mullerglauser W, Odermatt B, et al. Seeding with omental cells prevents late neointimal hyperplasia in small diameter darcon grafts. Circulation, 1995; 92:2605.
基金项目：国家自然科学基金资助（30170970）
哈尔滨医科大学附属第二临床医学院整形外科 （哈尔滨，150086）
图1、2：2代和5代内皮细胞均呈扁平的短梭形或多角形，大小均匀，核仁清晰。细胞单层呈典型的铺路石样镶嵌排列生长。(×200)
Fig.1、2 the 2nd and 5th endothelial cells show flat short-shuttled shape or polygon and uniformity of size, and nucleus is clear. The endothelial cell layer shows slabstone appearance enchased arrange. (×200)
图3：呈杆状细胞器，其纵切面有平行细管包埋在高电子密度的基质中。箭头示W-P小体(×40K)
Fig.3 W-P small body arrowhead showed is pole-like cell organ. Its slited surface shows parallel tubule embedded high electron-density matrix. (×40K)
图4：经胰酶和tritonX-100分别作用24小时和176小时后未见蓝染核物质和细胞碎片残留，仅见弹力纤维和胶原。(HE×200)
Fig.4 cellularized matrix tubes were obtained by a 0.1% trypsin and 0.02% EDTA solution for 24hr and 1% Triton X-100 for 176hr, and there was no blue-stained nucleus and cell pieces, and the remaining extracellular matrix consisted of collagen and elastin fibres. (HE×200)
图5：脱细胞基质种植内皮细胞16小时后仅内膜面有不连续紫染的细胞存在，其余部分无细胞存在。(HE×200)
Fig.5 after 16hr endothelial cells were seeded on extracellular matrix, HE staining showed round endothelial cells on the surface, and there was no penetration of any cell type into the acellular matix.(HE×200)
图6：经胰酶和tritonX-100分别作用24小时和176小时的血管内皮细胞层被全部祛除，细胞外基质纤维粗细不等相互交织排列呈1-10μm的微孔。(×4000)
Fig.6 cellularized matrix were obtained by a 0.1% trypsin and 0.02% EDTA solution for 24hr and 1% Triton X-100 for 176hr. the endothelial cell layer was completely removed.and the extracellular matrix fibres with openings of 1-10μm. (×4000)
图7：脱细胞基质种植内皮细胞16小时后发育良好的内皮细胞成群的分布于移植物表面，多呈圆形和椭圆形，有的粘附成团，有的紧密相接。(×1000)
Fig.7 after 16hr endothelial cells were seeded on extracellular matrix, endothelial cells showing round or oval shape distributed agminately on surface of graft. (×1000)
脱细胞基质与血管内皮细胞的体外相容性的试验
【摘要】目的 将猪血管内皮细胞和异体猪血管脱细胞基质相结合，开发一种制备血管移植物的新方法。方法 分别利用0.1%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸钠(EDTA)和1.0%Triton X-100对猪主动脉作用24h和176h进行脱细胞。异体猪内皮细胞分离出来并进行体外细胞扩增，再将脱细胞的血管内表面种植上内皮细胞。通过光镜和扫描电镜检验脱细胞血管基质是否存在细胞成分和内皮细胞是否生长其上。结果 酶-化学除垢剂的脱细胞方法几乎使细胞完全脱落，且基质纤维的三维结构变得疏松。体外扩增的异体猪内皮细胞可以种植在脱细胞基质上并且具有伸展和增殖功能。结论 TritonX-100和胰蛋白酶制备的脱细胞基质与异体猪细胞具有良好的生物相容性，能结合到一起并在体外生成血管移植物。
【关键词】组织工程，血管移植物，细胞外基质，内皮细胞，种植
The experimental study of compatibility between acelluarized allogenic matrix and endothelial cell in vitro.
【Abstract 】：Objective：To develop a new method for a tissue engineered vascular graft combining endothelial cells and an acelluarized allogenic matrix. Methods: acellularized matrix tubes were obtained by a 0.1% trypsin and 0.02% EDTA solution for 24hr and 1% Triton X-100 for 176hr. Endothelial cells were isolated in parallel from alloaorta and expanded in vitro. Finally，the inner surface of acellularized matrix was reseeded with endothelial cells. Light microscopy and scanning electron microscopy performed analysis of acellularity and reseeding. Results: the acellularization procedure resulted in an almost complete removal of the original cells while the three-dimensional (3D) matrix was loosened. The acellular matrix could be reseeded with expanded endothelial cells in vitro, and endothelial cells had the potential of spread and proliferation. Conclusions: acellular matrix produced by Triton X-100 and trypsin possessed satisfactory biocompatibility for allogenic endothelial cell. Vascular grafts can be generated in vitro of endothelial cells and allogenic acelluarized matrix.
Key words: tissue engineering, vascular graft, cell matrix, endothelial cell, cell seeding
血管疾病是我国目前死亡率最高疾病之一，血管移植是其主要的外科治疗手段。目前临床最常应用血管替代物为自体大隐静脉，其中短期效果尚可。但由于血液动力学等因素的改变而易发生血管内膜增生、管壁纤维化和血管瘤等，因此不能满足永久替代的要求而往往需要再次手术[1]。涤纶(Dacron)等人工材料，可部分模拟人体血管的某些功能，但与自身血管相比弹性系数低、顺应性差及组织相容性差，可引起机体不同程度的免疫排斥反应。我们的试验应用胰蛋白酶和TritonX-100对猪主动脉进行处理，并以此为支架材料种植异体猪内皮细胞，构建新型的组织工程血管。为探索血管移植物的来源提供了一条新的思路。
1材料和方法
1．1材料和试剂
于屠宰场获取80~100kg家猪主动脉。TritonX-100，Ⅱ型胶原酶（Sigma）；内皮细胞生长因子（endothelial cell growth factor，bovine，bECGF）（Roche）；Hank's平衡盐溶液，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS），胰蛋白酶（1：250），EDTA，胎牛血清（fatal bovine serum，FBS），M199培养基，L-谷氨酰胺（Gibico）
1．2方法
1．2．1猪主动脉脱细胞的制备 获取猪的胸主动脉两根后，即将之保存在4℃ D-Hanks'平衡盐溶液中。热缺血时间少于10分钟。剥去其中一根血管外膜，将血管浸入1%新洁尔灭溶液中浸泡30分钟消毒。PBS冲洗若干遍，去除血管表面的新洁尔灭。然后将血管置于50ml离心管中，在37℃、5%co2的环境下，0.1%胰蛋白酶+0.02%EDTA作用24小时。之后，再用1%的Triton X-100溶液中26℃~28℃水浴振荡176小时。再将血管用PBS液反复冲洗几次以祛除残余物质，保存在4℃含Ca2+、Mg2+的Hank's 溶液中，并取材作HE染色和扫描电镜。
1．2．2细胞的提取和扩增 用含有青、链霉素（100U/ml）的D-Hanks'平衡盐溶液浸泡另一根猪主动脉10分钟后，剥去血管外膜，将其剪成2cm×2cm的组织块。组织块内膜面朝下浸于用0.1%II型胶原酶中，胶原酶仅浸没过内膜面。在37℃、5%co2孵箱中消化15~20分钟。用含10%FBS的M199培养液终止消化。收集消化液，1000r/min离心5分钟。弃上清，D-Hanks反复洗涤沉淀细胞两遍。用M199培养液制成细胞悬液，其中含10%FBS，0.15%ECGF，L-谷氨酰胺300μg/ml。调节细胞密度为5×105/cm2。置入50ml培养瓶中37℃、5%co2孵箱中培养。每2~3天换液一次。用0.25%胰酶和0.02%EDTA（PBS为溶剂）传代培养。取第2~5代内皮细胞用于种植和透射电镜检查。
1．2．3材料的处理和细胞的种植 将脱细胞的猪主动脉在无菌条件下剪成直径为1.5cm的组织块5块，置于24孔培养板中（内膜面朝上）紫外线灯下干燥24小时，使其微干。再滴入1~2滴胎牛血清，置于37℃、5%co2孵箱中孵育1~2小时。将内皮细胞用0.25%胰酶和0.02%EDTA常温下作用2~3分钟，见细胞变圆，间隙增大，轻微晃动培养瓶见有细胞已悬浮，即可用含10%FBS的M199培养液终止消化。1000r/min离心5分钟后，用D-Hanks反复洗涤细胞沉淀物两遍。用M199培养液制成细胞悬液，其中含10%FBS、0.15%VEGF，L-谷氨酰胺300μg/ml。调节细胞密度5×106/cm2，种植于预先放有脱细胞基质的24孔培养板中，置于37℃、5%co2孵箱中培养。12小时换液一次，于种植后16小时取材作HE染色和扫描电镜。
2结果
2．1内皮细胞培养情况 2~5代内皮细胞生长状况良好，内皮细胞呈扁平的短梭形或多角形，大小均匀，核仁清晰。细胞单层呈典型的铺路石样镶嵌排列生长（图1、2）。透射电镜检测可见典型的内皮细胞特征性细胞器W-P小体，其纵切面内有平行的细管包埋在高密度的基质中（图3）。表明培养的细胞为内皮细胞。
2．2组织学检查
2．2．1种植前脱细胞血管基质 （n=8）未见紫染核物质和细胞碎片残留，但可见弹力纤维排列规整。脱细胞血管基质已完全无细胞成分存在（图4）。
2．2．2种植内皮细胞后脱细胞血管基质：(n=8)内膜面可见有不连续蓝紫染的细胞存在。其余部分无核物质和细胞碎片残留。内皮细胞已经种植在脱细胞基质上(图5)。
2．3扫描电镜
种植前脱细胞血管基质的内皮细胞层被全部祛除，细胞外基质纤维粗细不等相互交织排列呈现1~10μm的微孔（图6）。种植内皮细胞后脱细胞血管基质可见发育良好的内皮细胞成群的分布于移植物表面，多呈圆形和椭圆形，有的黏附成团，有的紧密相接。细胞表面有丰富的球状突起。表明内皮细胞已种植在脱细胞基质上并且具有铺展和生长的能力（图7）。
3讨论
国内外已有用聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）等合成生物高分子为支架构筑组织工程血管的报道，但PGA等合成生物高分子的降解速率及力学性能还不能完全与生理状态血管相匹配[2、3]。我们应用韩雪峰等[4]制备脱细胞基质的方法制备组织工程血管支架。该支架由大量的可溶性胶原、弹性蛋白及氨基葡聚糖等大分子构成的复杂聚合体，与正常细胞外基质成分相似，其降解速度与细胞外基质生成速度相一致。Scott等[5]研究证明胶原和弹性蛋白等大分子在主动脉壁和主动脉瓣的相互关系对保持血管生物力学性质起关键作用。Meredith等[6、7、8、9]还分别证实细胞外基质对细胞代谢、功能、相互作用以及黏附有着重要作用。同时，由于异体细胞被清除，从而减小了脱细胞基质所引起免疫反应的可能。我们的光镜和扫描电镜检测也表明，制备的脱细胞基质保存了完整的弹力纤维和胶原等维持血管弹性的物质，其弹性良好，力学性能与正常血管相似，可防止动脉瘤的发生和血管壁的硬化。
我们在种植内皮细胞之前，用含有Ca2+、Mg2+的 Hank's保存脱细胞基质，是因为Ca2+、Mg2+对组织内部细胞之间黏附和细胞间结合的稳定性有重要作用，是细胞外液重要的离子。此外，用胎牛血清浸泡脱细胞基质有很多优点：①可提供内皮细胞在脱细胞基表面黏附和铺展的生长基质成分；②提供载体蛋白，可结合维生素和金属离子等；③中和残存的胰蛋白酶和TritonX-100的细胞毒性。用胎牛血清浸泡可能是脱细胞基质内皮细胞化最有利的机制之一。扫描电镜观察也表明，只要经过适当的处理，内皮细胞和异体脱细胞基质细胞均具有良好的生物相容性，使内皮细胞保持铺展和增殖的能力。
经过长期探索，人们已认识到内皮细胞是保持血管稳定性的天然调节物[10]。在血管损伤后，血管内皮细胞单层具有抗血栓形成和平滑肌细胞增生的作用，并且已在人和动物血管移植物模型中显示出有提高血管通畅率的能力[11、12]。因此，异体脱细胞基质的内皮化能够提高组织工程血管通畅率。但生理状态下血管内皮细胞与平滑肌细胞之间在形态结构和功能等方面相互影响，两细胞间的相互调节和影响是稳定血管壁结构的关键。同时体外静态培养与体内血液动力学环境下的内皮细胞在功能和形态方面存在着巨大的差异。因此，将来可通过生物反应器制备管形的组织工程血管，在体内实验中对内皮细胞和平滑肌细胞联合种植的脱细胞血管功能进行评价。
4参考文献
[1] Lawrie GM, Morris GCJr, Earle N. Long-time results of coronary bypass surgery. Analysis of 1698 patients followed 15 to 20 years. Ann Surg, 1991; 213:377.
[2] Niklason LE, Gao J, Abbott WM, et al. Functional arteries grown in vitro [see comments]. Science, 1999; 284(5413): 489.
[3] 熊 猛,艾玉峰,王 飏等. 采用组织工程方法体外构建血管模型的初步实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2001; 15(2): 109.
[4] 韩雪峰,杨大平,郭铁芳. 曲拉通X-100对制备猪胸主动脉脱细胞血管基影响. 中华外科杂志, 2002; 40(1):27.
[5] Scott M, Vesely I. Aortic valves cusp microstructure: the role of elastin. Ann Thorac Sury, 1995; 60: 391.
[6] Meredith JEJr, Fazeli B, Schwartz MA. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell, 1993; 4:953.
[7] Thoumine O, Nerem RM, Girard PR. Oscillatory shear stress and hydrostatic pressure modulate cell-matrix attachment proteins in cultured endothelial cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1995; 31:45.
[8] Lee RT, Berditchevski F, Cheng GC, et al. Integrin-mediated collagen matrix reorganization by cultured human vascular smooth muscle cells. Circ Res, 1995; 76(2): 209.
[9] Walluscheck KP, Steinhoff G, Haverich A. Endothelial cell seeding of native vascular surfaces. Eur J Vasc Endovasc Surg, 1996; 11(3): 290.
[10] Cines DB, Pollak ES, Buck CA, et al. Endothelial cells in physiology and in pathophysiology of vascular disorders. Blood, 1998; 91:3527.
[11] Deutsch M, Meinhart J, Vesely M, et al. In vitro endothelialization of expanded polytetrafluorothylene grafts: A clinical case report after 41 months of implantation. J.Vasc.Surg, 1997; 25:757.
[12] Pasic M, Mullerglauser W, Odermatt B, et al. Seeding with omental cells prevents late neointimal hyperplasia in small diameter darcon grafts. Circulation, 1995; 92:2605.
基金项目：国家自然科学基金资助（30170970）
哈尔滨医科大学附属第二临床医学院整形外科 （哈尔滨，150086）
图1、2：2代和5代内皮细胞均呈扁平的短梭形或多角形，大小均匀，核仁清晰。细胞单层呈典型的铺路石样镶嵌排列生长。(×200)
Fig.1、2 the 2nd and 5th endothelial cells show flat short-shuttled shape or polygon and uniformity of size, and nucleus is clear. The endothelial cell layer shows slabstone appearance enchased arrange. (×200)
图3：呈杆状细胞器，其纵切面有平行细管包埋在高电子密度的基质中。箭头示W-P小体(×40K)
Fig.3 W-P small body arrowhead showed is pole-like cell organ. Its slited surface shows parallel tubule embedded high electron-density matrix. (×40K)
图4：经胰酶和tritonX-100分别作用24小时和176小时后未见蓝染核物质和细胞碎片残留，仅见弹力纤维和胶原。(HE×200)
Fig.4 cellularized matrix tubes were obtained by a 0.1% trypsin and 0.02% EDTA solution for 24hr and 1% Triton X-100 for 176hr, and there was no blue-stained nucleus and cell pieces, and the remaining extracellular matrix consisted of collagen and elastin fibres. (HE×200)
图5：脱细胞基质种植内皮细胞16小时后仅内膜面有不连续紫染的细胞存在，其余部分无细胞存在。(HE×200)
Fig.5 after 16hr endothelial cells were seeded on extracellular matrix, HE staining showed round endothelial cells on the surface, and there was no penetration of any cell type into the acellular matix.(HE×200)
图6：经胰酶和tritonX-100分别作用24小时和176小时的血管内皮细胞层被全部祛除，细胞外基质纤维粗细不等相互交织排列呈1-10μm的微孔。(×4000)
Fig.6 cellularized matrix were obtained by a 0.1% trypsin and 0.02% EDTA solution for 24hr and 1% Triton X-100 for 176hr. the endothelial cell layer was completely removed.and the extracellular matrix fibres with openings of 1-10μm. (×4000)
图7：脱细胞基质种植内皮细胞16小时后发育良好的内皮细胞成群的分布于移植物表面，多呈圆形和椭圆形，有的粘附成团，有的紧密相接。(×1000)
Fig.7 after 16hr endothelial cells were seeded on extracellular matrix, endothelial cells showing round or oval shape distributed agminately on surface of graft. (×1000)
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 1738
回复2 点赞
