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核酸技术

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论坛首页  >  核酸基因技术讨论版   >  LncRNA
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lncRNA pull down [精华]

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楼主 binglangcha
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lncRNA最近比较火热,目前的研究已经不局限于研究它和miRNA 的ceRNA功能,更多的开始研究lncRNA binding protein,这就涉及到lncRNA pulldown 的方法。看到论坛里,好多童鞋都在问它的具体protocol,我有时候也回答一些,这里就具体写一下,希望对大家有帮组。

lncRNA pulldown,最近比较流行的是有三种方法,分别是Chromatin Isolation by RNA purification (ChIRP), RNA Antisense Purification with Mass Spectrometry (RAP-MS)和Capture hybridization analysis of RNA targets (CHART). 三种方法具体的原理差不多。


ChIRP是有大神斯坦福大学Howard Chang实验室开发出来的,某次开会见过他一次好像是台湾人,关于他的具体文章大家自己去pubmed搜索去,好多好多,他们也做癌症的通路,lncRNA功能学。这个方法的详细步骤请打开连接https://www.jove.com/video/3912/chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp,一步一步都很详细。

RAP-MS,是加州理工Mitchell Guttman开发的,加州理工就是《生活大爆炸》那个学校,Mitchell大叔也很厉害,顶级期刊发了好多,凑巧也见过大叔本人,很和蔼。RAP-MS具体步骤请看发表文章https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-7213-5_31,或者他实验室主页http://guttmanlab.caltech.edu/protocols.php。在主页里,他们贴出了不同的步骤用于研究RNA-DNA,RNA-RNA, RNA-protein 互相作用,大家可以具体下载。

CHART,我本人没有用过,也有很多人用,具体介绍和方法请看http://simonlab.yale.edu/research/lncrnas-chromatin/chart/。

我上传了ChIRP和RAP-MS方法,需要的也可以直接拿去。


我本人具体看了ChIRP和RAP-MS,在我的实验里,我更多的采用了后者的方法,但是也柔和了前者部分, 具体如下:

关于Antisense biotin labeling probes,RAP-MS是他们实验室自己设计的,大概是每个90-nucleotides oligos,设计完之后,要做blast去除非特异性的probes. ChIRP protol 提供了一个在线设计的工具 LGC Bioresearch,不同的是它是20-nucleotides oligos,并且网站自己个给出了probes的等级。记得它会提示每一个lncRNA至少需要多少个probes(具体数字记不清了),所以你尽量先选择等级高的,然后如果不够在选择等级低的。在选择好probes之后,我自己还在blast,去除非特异probes. 这样在最终选择好相应的probes之后,直接提交付款就可以了。收到probes之后,你要把probe都mix在一起,具体怎么稀释怎么mix,根据自己的步骤具体看吧。


多说几句,如果你要做Mass Spectrometry,因为我们皮肤头发汗液等很多角蛋白之类的,所以尽量在RNA 超净台上操作吧,同时实验多设计几个negative controls. 我自己设计了3个negative controls, a看文献找出一个非相关基因设计它的probes, b 在hybridazation前样品进行RNAase treatment,这样就把lncRNA降解掉,理论上没有 binding protein, c不做uv crosslink, 这样在最开始一步RNA-protein就不能偶联,antisense probes 把RNA pulldown下来,protein不能被拽下来。这些都是我的建议,大家也可以根据自己情况设计自己的negative controls.


这个流程下来,并不难,大家把protocol认真读几遍,其实就理解了,有问题可以具体留言。







  • Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP).docx(26.36k)

  • RAP_MS_Protocol_April2015_Full.pdf(158.27k)
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2019-02-01 22:41 浏览 : 8426 回复 : 17
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楼主 binglangcha
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