lncRNA最近比较火热，目前的研究已经不局限于研究它和miRNA 的ceRNA功能，更多的开始研究lncRNA binding protein,这就涉及到lncRNA pulldown 的方法。看到论坛里，好多童鞋都在问它的具体protocol，我有时候也回答一些，这里就具体写一下，希望对大家有帮组。

lncRNA pulldown，最近比较流行的是有三种方法，分别是Chromatin Isolation by RNA purification (ChIRP), RNA Antisense Purification with Mass Spectrometry (RAP-MS)和Capture hybridization analysis of RNA targets （CHART）. 三种方法具体的原理差不多。

ChIRP是有大神斯坦福大学Howard Chang实验室开发出来的，某次开会见过他一次好像是台湾人，关于他的具体文章大家自己去pubmed搜索去，好多好多，他们也做癌症的通路，lncRNA功能学。这个方法的详细步骤请打开连接https://www.jove.com/video/3912/chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp，一步一步都很详细。

RAP-MS，是加州理工Mitchell Guttman开发的，加州理工就是《生活大爆炸》那个学校，Mitchell大叔也很厉害，顶级期刊发了好多，凑巧也见过大叔本人，很和蔼。RAP-MS具体步骤请看发表文章https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-7213-5_31，或者他实验室主页http://guttmanlab.caltech.edu/protocols.php。在主页里，他们贴出了不同的步骤用于研究RNA-DNA,RNA-RNA, RNA-protein 互相作用，大家可以具体下载。

CHART,我本人没有用过，也有很多人用，具体介绍和方法请看http://simonlab.yale.edu/research/lncrnas-chromatin/chart/。

我上传了ChIRP和RAP-MS方法,需要的也可以直接拿去。

我本人具体看了ChIRP和RAP-MS，在我的实验里，我更多的采用了后者的方法，但是也柔和了前者部分, 具体如下：

关于Antisense biotin labeling probes,RAP-MS是他们实验室自己设计的，大概是每个90-nucleotides oligos,设计完之后，要做blast去除非特异性的probes. ChIRP protol 提供了一个在线设计的工具 LGC Bioresearch，不同的是它是20-nucleotides oligos，并且网站自己个给出了probes的等级。记得它会提示每一个lncRNA至少需要多少个probes（具体数字记不清了），所以你尽量先选择等级高的，然后如果不够在选择等级低的。在选择好probes之后，我自己还在blast,去除非特异probes. 这样在最终选择好相应的probes之后，直接提交付款就可以了。收到probes之后，你要把probe都mix在一起，具体怎么稀释怎么mix，根据自己的步骤具体看吧。

多说几句，如果你要做Mass Spectrometry,因为我们皮肤头发汗液等很多角蛋白之类的，所以尽量在RNA 超净台上操作吧，同时实验多设计几个negative controls. 我自己设计了3个negative controls, a看文献找出一个非相关基因设计它的probes, b 在hybridazation前样品进行RNAase treatment，这样就把lncRNA降解掉，理论上没有 binding protein, c不做uv crosslink, 这样在最开始一步RNA-protein就不能偶联，antisense probes 把RNA pulldown下来，protein不能被拽下来。这些都是我的建议，大家也可以根据自己情况设计自己的negative controls.

这个流程下来，并不难，大家把protocol认真读几遍，其实就理解了，有问题可以具体留言。

• Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP).docx(26.36k)


• RAP_MS_Protocol_April2015_Full.pdf(158.27k)

大神大神