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细胞学与信号转导

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WB实验小白，条带就是跑不出来，求助。

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楼主

可苦可乐A88E

入门站友

1楼

细胞样本，RIPA强裂解液低温裂解，BCA测蛋白浓度按上样20ug计算上样体积大概在5-10ul，用的4×的上样缓冲液，100℃变性5min，10％，12孔的胶，每孔上样20ul，100v恒压电泳到溴酚蓝到达底部，低温转NC膜100v，1h。丽春红染色，之后洗膜，封闭液封闭1h，过夜敷一抗，敷荧光二抗，然后除了marker啥也看不到

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2019-09-19 16:08 来自 Android客户端浏览 : 795 回复 : 13

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• 心率40次/分、氧饱和测不出，PCO2 78.9！

机智的小柯基

常驻站友

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2楼

感觉是抗体的问题，操作就算有问题也不可能一点信号都没有，而且内参都发不出来，我觉得二抗出问题的可能比较大。因为我之前做的时候也是一张白板，换了二抗之后就发的很好了

2019-09-20 11:17 来自 Android客户端

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• 丁香早知道 - 1.15 | 患者丈夫醉酒扬言要杀医，是什么让医生如此彷徨？

楼主

可苦可乐A88E

入门站友

3楼

Austin1314
感觉是抗体的问题，操作就算有问题也不可能一点信号都没有，而且内参都发不出来，我觉得二抗出问题的可能比较大。因为我之前做的时候也是一张白板，换了二抗之后就发的很好了

请问您用的是哪种二抗呀？荧光二抗还是HRP呢？丽春红染色之后能看到的条带特别浅是为什么呢？42kda-68Kda的蛋白转膜可以一起转吗？大概多久呢，我真是刚接触这个实验，不会的特别多，问了好多问题，希望您不要介意谢谢😊

2019-09-21 10:08 来自 Android客户端

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• 16岁男孩颅骨局限型增厚怎么回事？

丁香园版主

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4楼

可苦可乐A88E
请问您用的是哪种二抗呀？荧光二抗还是HRP呢？丽春红染色之后能看到的条带特别浅是为什么呢？42kda-68Kda的蛋白转膜可以一起转吗？大概多久呢，我真是刚接触这个实验，不会的特别多，问了好多问题，希望您不要介意谢谢😊

42kda-68Kda可以一起转的，我们一般是100v, 90min；

也有可能是你样品制备的问题，100℃建议煮10-15min; 有阳性样品的话可以一起跑看看；

2019-09-22 16:52

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• 博士上岸，年底感谢园子