各位大神，用的是vazyme P501，

ddH2O                                                                              32ul
5 × SF Buffer (with 10 mM MgSO4)                          10ul
dNTP Mix (10 mM each)                                                1ul
上游引物 (10 μM)                                                           2ul
下游引物 (10 μM)                                                           2ul          
模板cDNA                                                                      10ng
Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase                       1ul

DMSO                                                                                1ul

反应程序:

预变性         95℃          5min
变性              95℃          10sec
退火              58℃          10sec

延伸              72℃          3min
彻底延伸      72℃          5min

退火温度分别为：55、56.7、59.1、62.9、64.9

质粒大小为6.4kb，延伸时间为2-4kb/min，2.5min 的也试过。

框出来的区域为模板，P出来的是啥啊。。。。

将酶改为0.5ul 之后，跑出来的琼脂糖胶还是长这样。。。

之前有试过用KOD,transgen的pfu，设置了温度梯度，都没有P出来，引物确定是没有问题的。。。

有没有大神指导原因啊，已经P了很久了这个。。。

就是引物序列没有出错的意思，除了点突变的位置，其他都是与模板相同的