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【讨论】关于免疫组化背景高

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楼主

fpinzaghi

骨科

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1楼

这个帖子发布于4年零198天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

最近新手做免疫组化，感觉背景都很高啊，皮下纤维倒是没怎么染色，但是镜下其他组织很明显的一片棕色，特别是肌肉组织。我是做一个分泌因子的免疫组化，感觉应该是背景太高，请高手帮我看看是没封闭完全？还是内源性过氧化物酶没消除好？顺便贴上我的步骤如下，谢谢！
1、常规脱水脱蜡：
（1）将玻片放置于60℃烘箱烤片30min
（2）将玻片依次浸入二甲苯10min（3次）、无水乙醇5min（2次）、95%乙醇5min（1次）、90%乙醇5min（1次）、85%乙醇5min（1次）、75%乙醇5min（1次）、蒸馏水5min（1次）、PBS冲洗3min（3次）
2、抗原修复：将37℃预热的0.25%胰酶溶液滴加在组织上完全覆盖，放入湿盒，置于37℃环境孵育30min
3、阻断内源性过氧化物酶：甩去胰酶，浸入3%双氧水（蒸馏水稀释）中，置于37℃环境孵育10min，之后用PBS洗5min（3次）
4、抗原封闭：滴加山羊血清封闭液，放入湿盒，置于37℃环境孵育20min，甩去血清
5、一抗孵育：按说明书比例稀释一抗，恢复至室温后滴加至玻片上，放入湿盒，与4℃孵育过夜
6、二抗孵育：取出玻片，室温复温30min，于PBS中洗5min（3次）；滴加即用型免疫组化Elivision plus试剂盒增强剂，室温孵育20min；再用PBS洗3min（3次）；滴加酶标抗鼠/兔聚合物，室温孵育30min；PBS洗3min（3次）
7、显色（迈新试剂盒）：配置DAB显色液（按每片切片50ul量，试剂A 1ml+试剂B 50ul+试剂C 50ul）；滴加DAB显色液，显微镜下观察3-5min，及时终止；蒸馏水冲洗5min（3次）
8、复染：滴加苏木素，染色30s-1min，1%盐酸酒精分色5-10s，PBS返蓝1min（最多至5min），蒸馏水冲洗5min（3次）
9、脱水透明：75%乙醇30s（1次），95%乙醇30s（1次），无水乙醇1min（3次），二甲苯1min（3次），封片观察