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【讨论】关于免疫组化背景高

未知医学生 · 最后编辑于 2022-10-09 · IP 山西山西
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这个帖子发布于 10 年零 4 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近新手做免疫组化,感觉背景都很高啊,皮下纤维倒是没怎么染色,但是镜下其他组织很明显的一片棕色,特别是肌肉组织。我是做一个分泌因子的免疫组化,感觉应该是背景太高,请高手帮我看看是没封闭完全?还是内源性过氧化物酶没消除好?顺便贴上我的步骤如下,谢谢!
1、常规脱水脱蜡:
(1) 将玻片放置于60℃烘箱烤片30min
(2) 将玻片依次浸入二甲苯10min(3次)、无水乙醇5min(2次)、95%乙醇5min(1次)、90%乙醇5min(1次)、85%乙醇5min(1次)、75%乙醇5min(1次)、蒸馏水5min(1次)、PBS冲洗3min(3次)
2、抗原修复:将37℃预热的0.25%胰酶溶液滴加在组织上完全覆盖,放入湿盒,置于37℃环境孵育30min
3、阻断内源性过氧化物酶:甩去胰酶,浸入3%双氧水(蒸馏水稀释)中,置于37℃环境孵育10min,之后用PBS洗5min(3次)
4、抗原封闭:滴加山羊血清封闭液,放入湿盒,置于37℃环境孵育20min,甩去血清
5、一抗孵育:按说明书比例稀释一抗,恢复至室温后滴加至玻片上,放入湿盒,与4℃孵育过夜
6、二抗孵育:取出玻片,室温复温30min,于PBS中洗5min(3次);滴加即用型免疫组化Elivision plus试剂盒增强剂,室温孵育20min;再用PBS洗3min(3次);滴加酶标抗鼠/兔聚合物,室温孵育30min;PBS洗3min(3次)
7、显色(迈新试剂盒):配置DAB显色液(按每片切片50ul量,试剂A 1ml+试剂B 50ul+试剂C 50ul);滴加DAB显色液,显微镜下观察3-5min,及时终止;蒸馏水冲洗5min(3次)
8、复染:滴加苏木素,染色30s-1min,1%盐酸酒精分色5-10s,PBS返蓝1min(最多至5min),蒸馏水冲洗5min(3次)
9、脱水透明:75%乙醇30s(1次),95%乙醇30s(1次),无水乙醇1min(3次),二甲苯1min(3次),封片观察
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