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形态学与生理生化

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论坛首页  >  形态学与生理生化讨论版   >  科研教学与技术方法
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HE染色流程+4%多聚甲醛配制

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楼主 chliang2006
chliang2006
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这个帖子发布于4年零198天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

一   HE染色各个教程不一致,有些步骤有误导之嫌,今发一贴,经验证效果不错,且较省时

二甲苯中脱蜡10分钟*2次。

无水乙醇2分钟*2次。

95%乙醇1分钟*2次。

80%乙醇1分钟。

75%乙醇1分钟。

自来水冲洗2分钟。

苏木素染色液染色5分钟(可以根据染色结果和要求调整时间)。

自来水中冲洗多余的染色液,约1分钟。

0.3%盐酸乙醇分化1-2秒(以75%乙醇为溶液配制1%盐酸:37%盐酸1ml,75%乙醇99ml)

自来水冲洗约30秒。

此时片子呈淡蓝色,很浅,但可分辨为蓝色,镜下鉴别见核呈漂亮的蓝色。

0.2%氨水返蓝1-2s(26%氨水0.2ml,自来水100ml)

自来水冲洗约约30秒。

 

伊红染色液染色1分钟(可根据染色结果和要求调整时间)。

自来水中冲洗去多余的染色液,约30秒。

此时片子呈粉红色或浅红色,但不能太浅,镜下鉴别,已成型的核及浆的染色。

 

脱水、透明、封片:

75%乙醇20s。

85%乙醇30s。

95%乙醇1min*2次。

无水乙醇2分钟*2次。

 

二甲苯透明2分钟*2次。

 

封片。

 

注意:

1. 片子先烤半小时不易脱片。

2.苏木素染色后的分化:分化过度则细胞核染色过浅,分化不足则染色过深,以切片由深蓝变成红色或粉红色时为佳。

3.乙醇脱水:低浓度乙醇有分化的作用,故时间宜短,高浓度乙醇脱水效果好,时间宜长,如果脱水不彻底则致切片发雾。

4.苏木素和/或伊红染色后如果效果不好,每一步都可重新来过,浅了重染,深了洗掉,镜下满意为止,然后再进行下一步,这叫关键环节的质量控制。

二   4%多聚甲醛配制

40g多聚甲醛加入0.1M PBS中,热浴至65度,磁力搅拌并加热65度,同时加入1M  NaOH约2ml,测PH值7-7.4,不能用PH计,有损仪器。约2小时后变澄清,0.2um微孔滤膜加漏斗过滤,存4度或负20度(长期)备用。

附: 1M  NaOH :0.4g NaOH加入10ml超纯水

0.1M PBS:  NaH2PO4•2H2O 2.964g,Na2HPO4•12H2O   29g,NaCl 0.78g加1L超纯水(所谓0.1M是0.1M磷酸根)。

另有不相关的:  用于免疫组化的0.01M PBS配方为:NaH2PO4•2H2O 0.2964g,Na2HPO4•12H2O   2.9g,NaCl 8g。如果用于细胞培养,可以用这个配方:NaCl 8.00,Na2HPO.12H2O 2.90,KCl      0.2,KH2PO4 0.24。偷自http://www.biohao.com/shownews.asp?id=288

3 1M HCl

36%的盐酸物质的量浓度是1000×1.18×36%/36.5=11.64mol/L
根据c1v1=c2v2
v1=c2v2/c1=100×1/11.64=8.6毫升
即取8.6毫升36%的盐酸加水、搅拌、定容至100毫升即可.

1M NaOH

40g NaOH加去超纯水1L

4 大鼠多聚甲醛灌注流程

麻醉(0.1ml 0.5%阿托品/只, 0.17-0.18ml 3%戊巴比妥钠//100g,自摸剂量,我的药过期了;或者10%水合氯醛,0.4ml/100g)。备新的一次性输液器,4度生理盐水及多聚甲醛。

小弯钳提起胸腹部皮肤以组织剪剪除,剑突下剪开上腹壁,沿前胸壁两侧自下向上剪断肋骨直至近锁骨处(先右侧,形成气胸后肺及纵隔塌陷,再剪断左侧肋骨,如此操作不易伤到左侧心脏),大弯钳夹剑突上翻暴露心脏,左手指固定心脏,右手执钝头针自心尖进针,小心进入主动脉,以手感触到位后小弯钳夹持,上齿,固定心尖进针处,剪开右心耳,4度生理盐水灌(可少加肝素阻凝),快速,同时卵圆钳自腹部夹闭。500ml后接4度4%多聚甲醛500ml,先快后慢。灌注>=4h。取脑,泡于4%多聚甲醛中24h,以4%多聚甲醛配制30%蔗糖,继续泡72h。冰冻切片略。

注意:正常灌注肝会变白,如果没变白,说明进针位置可能有问题,比如开胸后心左翻,致右心室暴露在左前方,针入右室则液入肺循环,肺变白而肝不变白,此时会有液体自鼻腔流出。但是即使这样,也不意味着失败,可能灌出来结果也不错。

目前的操作步骤有几点强调:麻醉用10%水合氯醛,0.45ml/100g;灌注用输液器必须是一次性的新输液器(新输液器省时省力,输液器很便宜,淘宝1元一套,实在不值得回收利用);4度生理盐水及多聚甲醛自配备用(80g多聚甲醛+2L超纯水+4ml 1Mol/L的NaOH,60度烘箱加温6小时,磁性搅拌子搅拌约半小时即溶解,蠕动泵辅助下过滤,泵速约1L/h,即微孔滤膜孔径:0.22um);心尖处进针入左心室并以弯钳固定;剪开右心耳而不是右心房(其实心耳是心房的一部分,但心耳解剖位置明确而易识别,操作更简单);灌注时间总计3小时后取脑效果可以。

5  微波柠檬酸抗原修复

0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):

柠檬酸三钠(C6H5Na3O7.2H2O):3g

柠檬酸(C6H8O7.H2O):0.4g。

据说配完PH值为6.08,不需调PH值。我有的试剂时间有点长,配完测试偏酸,需加1M NaOH 2.4ml后PH约为6.0

柠檬酸,0.01M,PH=6.0,1000ml,中高火或高火,5min,解冻 20min。

染片过程中不能有干片情况出现,不操作时泡在染缸内PBS中

切片3um,不要超过4um

染色过程中,如果玻片上加的液体中有气泡,必须用牙签挑破,否则着色不均.

6贴点不相关的:6.1修改win10中的文件夹权限;  6.2 excel中去掉自动生成另一个备份文件

6.1 修改这个文件权限:修改权限方法 : 右键访问文件……属性……安全……高级……所有者:system 更改C(点更改C)……高级……立即查找……在搜索结果(U)选框,点一下自己安装系统时给电脑起的名字,也就是一个小人头……确定……确定……在替换子容器和对象所有者前面打挑……应用……是……一路点确定.

6.2  文件---另存为----excel工作簿----在“另存为”界面中下缘,中间处选择“工具”----常规选项----清除”生成备份文件“前面的复选框中内容----确定----保存

7显微镜高倍镜照片tips

用olympus BX63摄片总算照出自己还算满意的片子了,留点小细节在此:高倍镜下图片中央光线太强,调白平衡无效,照片用IPP分析不准确。解决:1 在Olympus软件主界面中,(右上角)布局--还原当前布局;(右下角)显...(全称为显微镜控制)----BX3透射块光阑----最大值(即120%) 2 调整载物台下的聚光镜高度,实时观察界面,达最适位置

8 hoechst33258的配制

配储存液:25mg+DDH2O 940ul, 震荡混匀溶解,20ul/支(浓度50mM)分装,-20度保存

配工作液:储存液20ul+DDH2O 980ul,混匀。浓度为1mM,约532ug/ml。

使用时,滴于标本上,3min后PBS漂洗, 15min*3次

9 LDZX-50KBS蒸汽灭菌器

加待消毒物品,注意水位,纯化水加入至高水位指示灯亮为止(总量约需8L),设定消毒温度,123度,30min(规定是121度不少于20min),泄压阀与安全阀关闭状态,开机。

10 荧光基础知识

可见光相应波长    -----紫蓝青-----绿-----570-----黄-----590----橙----620----赤----

(七八九黄,六二零红。570,580,590范围内是黄色,620以上是红色,另外450-475是蓝色)

Ex excitation wavelength;  Em emission wavelength

激发波能量大,波长短;发射波能量低,波长长。

常用荧光染料颜色:

1Alexa Fluor 488 绿色荧光Ex: 488nm, Em: 519nm 

(注意, Em并非488,而是Ex是488,因此,名称与其颜色无关,实际颜色向红色端偏移,因发射波长能量小,波长更长,但488仍在绿色范围内)

2Cy3   橙色荧光  1.Ex(nm):555   2.Em(nm):565

3Mcherry 红色     587nm和610nm

11 漂染步骤

4度平衡2h----PBS漂洗10min*3----0.3%triton100 30min----PBS漂洗10min*3次----二抗封闭血清室温(23度)30min----勿洗,加一抗,摇床,24h----洗3次----二抗1h----洗3次----hoechst 5min----洗3次-----封片

12大鼠麻醉

3%戊巴比妥钠(10ml双蒸水+0.3g戊巴比妥钠)0.18ml/100g,加0.1ml阿托品(25mg/5ml). 腹腔注射。体型较小者比如200-300g,0.17ml/100g即可,体型较大者如400-500g,0.19ml/100g仍效果欠满意。注意:A动物称重一定要准确,精确到克;B起效可能有点慢,约10-15min后才达手术要求;C如仍不能达手术要求,比如上耳杆等刺激性较大的操作时,可加予乙醚辅助一下,方法如下:棉签蘸乙醚,放入50ml离心管中,离心管底部钻通,棉签尾杆自底穿出,离心管口套于鼠嘴,约1-2分钟后无挣扎即可,如果将离心管中段截除,头尾两段以胶布粘成一体,减小空间,则效果更好;D戊巴比妥钠过量动物易死亡,且其死亡多发于2小时以后,因此术后需观察动物至苏醒,注意保温,如果呼吸不好,则可多刺激避免呼吸抑制过度而死,在呼吸较弱时也可人工胸廓挤压帮助呼吸同时刺激可对抗过度抑制;E体温过低可空调升室温,但类似电热毯之类的东西 ,好像效果不好,易呼吸抑制而死(太舒服,忘记呼吸了?)

10%水合氯醛麻醉普通成年大鼠,400mg/Kg,麻醉效果好,但须注意,醒后当天禁食,次日喂水及食物,否则肠梗阻易死亡。

13免疫组化步骤注意:脱蜡要充分,二甲苯20min*3次,余略;PH6.0柠檬酸微波修复(1L),高火7min,低火20min;透膜:0.3% Triton-100 10min,5%血清封闭1h,37度。

14 不同PH值的PB配制(这里面个别的验算了一下,答案还可以,另外与百度词条中的一致http://baike.baidu.com/item/%E7%A3%B7%E9%85%B8%E7%BC%93%E5%86%B2%E6%B6%B2):  http://www.dxy.cn/bbs/thread/3387664#3387664

此外,这个网站可直接给答案,但是所给的Na2HPO4及NaH2PO4均是无水的,实际中用水合物,需换算一下。另外,部分有错误,算过一个ph7.8的0.01MPB的配方,NaH2PO4的摩尔数小数点向后移了一位。因此,只供参考。http://www.peprotech-asia.com/convertor/ch/phosphate.html  

配制PBS则加0.15M NaCl即可调渗透压至等渗。

附分子量:NaH2PO4·2H2O  156.01,Na2HPO4·12H2O  358.14, NaH2PO4   119.98, Na2HPO4  141.96

下面转贴百度磷酸缓冲液词条内容,其中的分子量略有出入,差异很小,可忽略。

0.2M磷酸缓冲液

磷酸缓冲液PH5.7--8.0(0.2M)

甲液:

NaH2PO4·2H2O:Mr=156.03,0.2mol/L溶液为31.21g/L,

NaH2PO4·H2O:Mr=138.01,0.2mol/L溶液为27.6g/L。

乙液:

Na2HPO4·2H2O:Mr=178.05,0.2mol/L溶液为35.61g/L,

Na2HPO4·7H2O:Mr=268.13,0.2mol/L溶液为53.624 g/L ,

Na2HPO4·12H2O:Mr=358.22,0.2mol/L溶液为71.64g/L。

磷酸缓冲液PH5.7--8.0(0.2M)

PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml) PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml)

5.7 93.5 6.5   6.9 45 55

5.8 92 8    7.0 39 61

5.9 90 10   7.1 33 67

6 87.7 12.3   7.2 28 72

6.1 85 15   7.3 23 77

6.2 81.5 18.5   7.4 19 81

6.3 77.5 22.5   7.5 16 84

6.4 73.5 26.5   7.6 13 87

6.5 68.5 31.5   7.7 10.5 89.5

6.6 62.5 37.5   7.8 8.5 91.5

6.7 56.5 43.5   7.9 7 93

6.8 51 49   8.0 5.3 94.7

根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液,混合均匀即得.


1/15M 磷酸缓冲液

磷酸缓冲液PH4.49--9.18(1/15M)

PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml) PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml)

4.4 90 10 6.98 64

4.9 4 0. 1 9.9 7.71 7 3

5.29 0.25 9.75 7.58 8 2

5.59 0.5 9.5 7.75 9 1

5.91 1 9 8.04 9.5 0.5

6.24 2 8 8.2 9.7 0.3

6.47 3 7 8.54 9.75 0.25

6.64 4 6 8.68 9.9 0.1

6.81 5 5 9.18 10 0

乙液:一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L

甲液:二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含11.864g/L

根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液,混合均匀即得.

15  30%双氧水稀释成3%

十倍稀释  比如需要3%的1000毫升,100毫升30%加900毫升水就行






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2016-07-11 00:34 浏览 : 22464 回复 : 16
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chliang2006 编辑于 2018-10-23 11:09
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近期准备做HE染色,多谢指导。

2016-07-12 16:45
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chenxiaojiuan
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chliang2006

一   HE染色各个教程不一致,有些步骤有误导之嫌,今发一贴,经验证效果不错,且较省时

二甲苯中脱蜡10分钟*2次。

 

无水乙醇2分钟*2次。

95%乙醇1分钟*2次。

80%乙醇1分钟。

75%乙醇1分钟。

自来水冲洗2分钟。

 

苏木素染色液染色5分钟(可以根据染色结果和要求调整时间)。

自来水中冲洗多余的染色液,约1分钟。

1%盐酸乙醇分化1-2秒(以75%乙醇为溶液配制1%盐酸:37%盐酸1ml,75%乙醇99ml)

自来水冲洗约30秒。

此时片子呈淡蓝色,很浅,但可分辨为蓝色,镜下鉴别见核呈漂亮的蓝色。

0.2%氨水返蓝1-2s(26%氨水0.2ml,自来水100ml)

自来水冲洗约约30秒。

 

伊红染色液染色1分钟(可根据染色结果和要求调整时间)。

自来水中冲洗去多余的染色液,约30秒。

此时片子呈粉红色或浅红色,但不能太浅,镜下鉴别,已成型的核及浆的染色。

 

脱水、透明、封片:

75%乙醇20s。

85%乙醇30s。

95%乙醇1min*2次。

无水乙醇2分钟*2次。

 

二甲苯透明2分钟*2次。

 

封片。

 

注意:

1. 片子先烤半小时不易脱片。

2.苏木素染色后的分化:分化过度则细胞核染色过浅,分化不足则染色过深,以切片由深蓝变成红色或粉红色时为佳。

3.乙醇脱水:低浓度乙醇有分化的作用,故时间宜短,高浓度乙醇脱水效果好,时间宜长,如果脱水不彻底则致切片发雾。

4.苏木素和/或伊红染色后如果效果不好,每一步都可重新来过,浅了重染,深了洗掉,镜下满意为止,然后再进行下一步,这叫关键环节的质量控制。

二   4%多聚甲醛配制

40g多聚甲醛加入0.1M PBS中,热浴至65度,磁力搅拌并加热65度,同时加入1M  NaOH约2ml,测PH值7-7.4,不能用PH计,有损仪器。约2小时后变澄清,0.2um微孔滤膜加漏斗过滤,存4度或负20度(长期)备用。

附: 1M  NaOH :0.4g NaOH加入10ml超纯水

0.1M PBS:  NaH2PO4•2H2O 2.964g,Na2HPO4•12H2O   29g,NaCl 0.78g加1L超纯水(所谓0.1M是0.1M磷酸根)。

另有不相关的:  用于免疫组化的0.01M PBS配方为:NaH2PO4•2H2O 0.2964g,Na2HPO4•12H2O   2.9g,NaCl 8g。如果用于细胞培养,可以用这个配方:NaCl 8.00,Na2HPO.12H2O 2.90,KCl      0.2,KH2PO4 0.24。偷自http://www.biohao.com/shownews.asp?id=288



想问下,你说的,40g多聚甲醛加入0.1MPBS中,这个PBS是多少ml呢?
2016-11-09 08:37 来自 Android客户端
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请问苏木素和伊红需要买哪个厂家的吗?

2016-11-09 10:26
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