一   HE染色各个教程不一致，有些步骤有误导之嫌，今发一贴，经验证效果不错，且较省时

二甲苯中脱蜡10分钟*2次。

无水乙醇2分钟*2次。

95%乙醇1分钟*2次。

80%乙醇1分钟。

75%乙醇1分钟。

自来水冲洗2分钟。

苏木素染色液染色5分钟（可以根据染色结果和要求调整时间）。

自来水中冲洗多余的染色液，约1分钟。

0.3%盐酸乙醇分化1-2秒（以75%乙醇为溶液配制1%盐酸：37%盐酸1ml，75%乙醇99ml）

自来水冲洗约30秒。

此时片子呈淡蓝色，很浅，但可分辨为蓝色，镜下鉴别见核呈漂亮的蓝色。

0.2%氨水返蓝1-2s（26%氨水0.2ml，自来水100ml）

自来水冲洗约约30秒。

伊红染色液染色1分钟（可根据染色结果和要求调整时间）。

自来水中冲洗去多余的染色液，约30秒。

此时片子呈粉红色或浅红色，但不能太浅，镜下鉴别，已成型的核及浆的染色。

脱水、透明、封片：

75%乙醇20s。

85%乙醇30s。

95%乙醇1min*2次。

无水乙醇2分钟*2次。

二甲苯透明2分钟*2次。

封片。

注意：

1. 片子先烤半小时不易脱片。

2．苏木素染色后的分化：分化过度则细胞核染色过浅，分化不足则染色过深，以切片由深蓝变成红色或粉红色时为佳。

3．乙醇脱水：低浓度乙醇有分化的作用，故时间宜短，高浓度乙醇脱水效果好，时间宜长，如果脱水不彻底则致切片发雾。

4.苏木素和/或伊红染色后如果效果不好，每一步都可重新来过，浅了重染，深了洗掉，镜下满意为止，然后再进行下一步，这叫关键环节的质量控制。

二   4%多聚甲醛配制

40g多聚甲醛加入0.1M PBS中，热浴至65度，磁力搅拌并加热65度，同时加入1M  NaOH约2ml，测PH值7-7.4，不能用PH计，有损仪器。约2小时后变澄清，0.2um微孔滤膜加漏斗过滤，存4度或负20度(长期）备用。

附: 1M  NaOH ：0.4g NaOH加入10ml超纯水

0.1M PBS:  NaH2PO4•2H2O 2.964g，Na2HPO4•12H2O   29g，NaCl 0.78g加1L超纯水(所谓0.1M是0.1M磷酸根）。

另有不相关的:  用于免疫组化的0.01M PBS配方为：NaH2PO4•2H2O 0.2964g，Na2HPO4•12H2O   2.9g，NaCl 8g。如果用于细胞培养，可以用这个配方：NaCl 8.00，Na2HPO.12H2O 2.90，KCl      0.2，KH2PO4 0.24。偷自http://www.biohao.com/shownews.asp?id=288

3 1M HCl

36%的盐酸物质的量浓度是1000×1.18×36%/36.5=11.64mol/L
根据c1v1=c2v2
v1=c2v2/c1=100×1/11.64=8.6毫升
即取8.6毫升36%的盐酸加水、搅拌、定容至100毫升即可.

1M NaOH

40g NaOH加去超纯水1L

4 大鼠多聚甲醛灌注流程

麻醉（0.1ml 0.5%阿托品/只, 0.17-0.18ml 3%戊巴比妥钠//100g,自摸剂量，我的药过期了；或者10%水合氯醛，0.4ml/100g）。备新的一次性输液器，4度生理盐水及多聚甲醛。

小弯钳提起胸腹部皮肤以组织剪剪除，剑突下剪开上腹壁，沿前胸壁两侧自下向上剪断肋骨直至近锁骨处（先右侧，形成气胸后肺及纵隔塌陷，再剪断左侧肋骨，如此操作不易伤到左侧心脏），大弯钳夹剑突上翻暴露心脏，左手指固定心脏，右手执钝头针自心尖进针，小心进入主动脉，以手感触到位后小弯钳夹持，上齿，固定心尖进针处，剪开右心耳，4度生理盐水灌（可少加肝素阻凝），快速，同时卵圆钳自腹部夹闭。500ml后接4度4%多聚甲醛500ml，先快后慢。灌注>=4h。取脑，泡于4%多聚甲醛中24h，以4%多聚甲醛配制30%蔗糖，继续泡72h。冰冻切片略。

注意：正常灌注肝会变白，如果没变白，说明进针位置可能有问题，比如开胸后心左翻，致右心室暴露在左前方，针入右室则液入肺循环，肺变白而肝不变白，此时会有液体自鼻腔流出。但是即使这样，也不意味着失败，可能灌出来结果也不错。

目前的操作步骤有几点强调：麻醉用10%水合氯醛，0.45ml/100g；灌注用输液器必须是一次性的新输液器（新输液器省时省力，输液器很便宜，淘宝1元一套，实在不值得回收利用）；4度生理盐水及多聚甲醛自配备用（80g多聚甲醛+2L超纯水+4ml 1Mol/L的NaOH，60度烘箱加温6小时，磁性搅拌子搅拌约半小时即溶解，蠕动泵辅助下过滤，泵速约1L/h，即微孔滤膜孔径：0.22um)；心尖处进针入左心室并以弯钳固定；剪开右心耳而不是右心房（其实心耳是心房的一部分，但心耳解剖位置明确而易识别，操作更简单）；灌注时间总计3小时后取脑效果可以。

5  微波柠檬酸抗原修复

0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：

柠檬酸三钠（C6H5Na3O7.2H2O）：3g

柠檬酸（C6H8O7.H2O）:0.4g。

据说配完PH值为6.08,不需调PH值。我有的试剂时间有点长，配完测试偏酸，需加1M NaOH 2.4ml后PH约为6.0

柠檬酸,0.01M,PH=6.0,1000ml,中高火或高火,5min，解冻 20min。

染片过程中不能有干片情况出现,不操作时泡在染缸内PBS中

切片3um,不要超过4um

染色过程中,如果玻片上加的液体中有气泡,必须用牙签挑破,否则着色不均.

6贴点不相关的：6.1修改win10中的文件夹权限;  6.2 excel中去掉自动生成另一个备份文件

6.1 修改这个文件权限：修改权限方法 : 右键访问文件……属性……安全……高级……所有者：system 更改C（点更改C)……高级……立即查找……在搜索结果（U）选框，点一下自己安装系统时给电脑起的名字，也就是一个小人头……确定……确定……在替换子容器和对象所有者前面打挑……应用……是……一路点确定.

6.2  文件---另存为----excel工作簿----在“另存为”界面中下缘，中间处选择“工具”----常规选项----清除”生成备份文件“前面的复选框中内容----确定----保存

7显微镜高倍镜照片tips

用olympus BX63摄片总算照出自己还算满意的片子了，留点小细节在此：高倍镜下图片中央光线太强，调白平衡无效，照片用IPP分析不准确。解决：1 在Olympus软件主界面中，（右上角）布局--还原当前布局；（右下角）显...（全称为显微镜控制)----BX3透射块光阑----最大值（即120%） 2 调整载物台下的聚光镜高度，实时观察界面，达最适位置

8 hoechst33258的配制

配储存液：25mg+DDH2O 940ul, 震荡混匀溶解，20ul/支（浓度50mM)分装，-20度保存

配工作液：储存液20ul+DDH2O 980ul，混匀。浓度为1mM,约532ug/ml。

使用时，滴于标本上，3min后PBS漂洗, 15min*3次

9 LDZX-50KBS蒸汽灭菌器

加待消毒物品，注意水位，纯化水加入至高水位指示灯亮为止（总量约需8L)，设定消毒温度，123度，30min（规定是121度不少于20min)，泄压阀与安全阀关闭状态，开机。

10 荧光基础知识

可见光相应波长    -----紫蓝青-----绿-----570-----黄-----590----橙----620----赤----

（七八九黄，六二零红。570,580,590范围内是黄色，620以上是红色，另外450-475是蓝色）

Ex excitation wavelength;  Em emission wavelength

激发波能量大，波长短；发射波能量低，波长长。

常用荧光染料颜色：

1Alexa Fluor 488 绿色荧光Ex: 488nm, Em: 519nm 

（注意， Em并非488，而是Ex是488，因此，名称与其颜色无关，实际颜色向红色端偏移，因发射波长能量小，波长更长，但488仍在绿色范围内）

2Cy3   橙色荧光  1.Ex(nm)：555   2.Em(nm)：565

3Mcherry 红色     587nm和610nm

11 漂染步骤

4度平衡2h----PBS漂洗10min*3----0.3%triton100 30min----PBS漂洗10min*3次----二抗封闭血清室温（23度）30min----勿洗，加一抗，摇床，24h----洗3次----二抗1h----洗3次----hoechst 5min----洗3次-----封片

12大鼠麻醉

3%戊巴比妥钠（10ml双蒸水+0.3g戊巴比妥钠）0.18ml/100g，加0.1ml阿托品（25mg/5ml). 腹腔注射。体型较小者比如200-300g，0.17ml/100g即可，体型较大者如400-500g，0.19ml/100g仍效果欠满意。注意：A动物称重一定要准确，精确到克；B起效可能有点慢，约10-15min后才达手术要求；C如仍不能达手术要求，比如上耳杆等刺激性较大的操作时，可加予乙醚辅助一下，方法如下：棉签蘸乙醚，放入50ml离心管中，离心管底部钻通，棉签尾杆自底穿出，离心管口套于鼠嘴，约1-2分钟后无挣扎即可，如果将离心管中段截除，头尾两段以胶布粘成一体，减小空间，则效果更好；D戊巴比妥钠过量动物易死亡，且其死亡多发于2小时以后，因此术后需观察动物至苏醒，注意保温，如果呼吸不好，则可多刺激避免呼吸抑制过度而死，在呼吸较弱时也可人工胸廓挤压帮助呼吸同时刺激可对抗过度抑制；E体温过低可空调升室温，但类似电热毯之类的东西 ，好像效果不好，易呼吸抑制而死（太舒服，忘记呼吸了？）

10%水合氯醛麻醉普通成年大鼠，400mg/Kg，麻醉效果好，但须注意，醒后当天禁食，次日喂水及食物，否则肠梗阻易死亡。

13免疫组化步骤注意：脱蜡要充分，二甲苯20min*3次，余略；PH6.0柠檬酸微波修复（1L)，高火7min，低火20min；透膜：0.3% Triton-100 10min，5%血清封闭1h，37度。

14 不同PH值的PB配制（这里面个别的验算了一下，答案还可以，另外与百度词条中的一致http://baike.baidu.com/item/%E7%A3%B7%E9%85%B8%E7%BC%93%E5%86%B2%E6%B6%B2）：  http://www.dxy.cn/bbs/thread/3387664#3387664

此外，这个网站可直接给答案，但是所给的Na2HPO4及NaH2PO4均是无水的，实际中用水合物，需换算一下。另外，部分有错误，算过一个ph7.8的0.01MPB的配方，NaH2PO4的摩尔数小数点向后移了一位。因此，只供参考。http://www.peprotech-asia.com/convertor/ch/phosphate.html  

配制PBS则加0.15M NaCl即可调渗透压至等渗。

附分子量：NaH2PO4·2H2O  156.01，Na2HPO4·12H2O  358.14， NaH2PO4   119.98， Na2HPO4  141.96

下面转贴百度磷酸缓冲液词条内容，其中的分子量略有出入，差异很小，可忽略。

0.2M磷酸缓冲液

磷酸缓冲液PH5.7--8.0(0.2M)

甲液：

NaH2PO4·2H2O：Mr=156.03，0.2mol/L溶液为31.21g/L，

NaH2PO4·H2O：Mr=138.01，0.2mol/L溶液为27.6g/L。

乙液：

Na2HPO4·2H2O：Mr=178.05，0.2mol/L溶液为35.61g/L，

Na2HPO4·7H2O：Mr=268.13，0.2mol/L溶液为53.624 g/L ，

Na2HPO4·12H2O：Mr=358.22，0.2mol/L溶液为71.64g/L。

磷酸缓冲液PH5.7--8.0(0.2M)

PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml) PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml)

5.7 93.5 6.5   6.9 45 55

5.8 92 8    7.0 39 61

5.9 90 10   7.1 33 67

6 87.7 12.3   7.2 28 72

6.1 85 15   7.3 23 77

6.2 81.5 18.5   7.4 19 81

6.3 77.5 22.5   7.5 16 84

6.4 73.5 26.5   7.6 13 87

6.5 68.5 31.5   7.7 10.5 89.5

6.6 62.5 37.5   7.8 8.5 91.5

6.7 56.5 43.5   7.9 7 93

6.8 51 49   8.0 5.3 94.7

根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液,混合均匀即得.

1/15M 磷酸缓冲液

磷酸缓冲液PH4.49--9.18(1/15M)

PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml) PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml)

4.4 90 10 6.98 64

4.9 4 0. 1 9.9 7.71 7 3

5.29 0.25 9.75 7.58 8 2

5.59 0.5 9.5 7.75 9 1

5.91 1 9 8.04 9.5 0.5

6.24 2 8 8.2 9.7 0.3

6.47 3 7 8.54 9.75 0.25

6.64 4 6 8.68 9.9 0.1

6.81 5 5 9.18 10 0

乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L

甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含11.864g/L

根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液,混合均匀即得.

15  30%双氧水稀释成3%

十倍稀释  比如需要3%的1000毫升，100毫升30%加900毫升水就行

近期准备做HE染色，多谢指导。