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【求助】primer5.0引物设计所用序列为什么是mRNA?

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楼主

tracy加油

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1楼

这个帖子发布于5年零351天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

问题已解决悬赏丁当:5

做qRT-PCR时设计引物是直接将NCBI的mRNA区域中CDS区序列拷贝到primer5.0里面，可是做qRT-PCR前不是有一步是将RNA逆转录成cDNA吗？那以mRNA设计引物不是反了吗？我觉得是应该以mRNA的互补序列设计引物才对啊？请高人指点一下，谢谢！附图为人β-actin的mRNA的CDS区，好像设计引物就是把这段序列拷到primer5.0里

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2014-02-05 21:49 浏览 : 12353 回复 : 21

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elainechang 编辑于 2014-02-05 21:54

• 丁香早知道 - 1.17 | 国内首例！72岁高位截瘫患者用意念喝可乐、打麻将

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新天

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热

14楼

满意答案

elainechang
哦，这样啊，好的，谢谢哈！
那个不好意思再问最后一个问题了，就是您说引物一条与mRNA互补，另一条与之相同，我看primer bank 里面也是这样的，但是如果是这样那primer5.0里面search出来的不是都是互补的嘛？没看到有相同的啊？最后最后了，麻烦您了！
http://pga.mgh.harvard.edu/cgi-bin/primerbank/new_displayDetail2.cgi?primerID=4501885a1

你注意一下设计引物的软件就会明白了。依然以“AAAAAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTTTTT”这个序列为例，你把这个序列放到软件里，编辑sense（S）引物时，软件会自动将模版转换成互补链，即TTTTT...GGGG...AAAA...这个时候得到的引物就是和模版相同的，在软件里显示的互补其实是和互补链的互补；编辑A引物时，模板会变回来，得到的引物就是互补的引物，你自己注意一下就明白了。
要是问题解决了就记得给分啊！O(∩_∩)O~

2014-02-09 09:02

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新天

铁杆站友

8楼

elainechang
谢谢您的耐心解答，我一开始是错以为逆转录后得到的是单链了，但是您后来说的我又不明白了：qRT-PCR的开头2，3个循环为何是单链扩增呢？
还有关于引物设计的问题，我还是有几个不太明白，比如我设计人β-actin的引物（Gene ID:60），把NCBI上的CDS区拷到primer5.0后，点击search，出现如下界面应该是直接点OK吧？

然后

选择第一个89分的，能够看到Anti-Sense的Tm是64.3℃，然后点sense，看到Tm是64.3℃，我不明白的是如果这对排名第一的引物下面都是“None”,那如果想改变Tm值怎么办呢？还有sense的GC%含量是63.2%，这些都是需要通过"edit primer“把GC含量控制在40-60%吗？但是已经都是“none”了万一edit primer使得Tm和GC含量符合标准了而下面又出现了”found“怎么办呢？
还有就是如果排名第一的都这么完美了那人β-actin的qRT-PCR的引物岂不是大家都应该用的一样吗？

不好意思哈，我确实比较愚钝，呵呵，谢谢高手指点！

其他人问我PCR的事都是很简单的，很少有人会问这么细！我就多说一点吧。
1.如果要说得详细、准确一点，那逆转录后得到应该是DNA和RNA的混合双链，RNA是原先的模板，DNA则是新合成的链。fermentas公司的逆转录试剂盒就叫“RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit”，明确说明是合成一条链的。
2.在做RT-PCR时，DNA和RNA的混合双链中只有DNA链可以作为模板，因为RT-PCR所用的Taq酶不具备以RNA为模版合成DNA的功能或者合成效率很低，再就是RNA容易降解。这里也说明开头一个反应是单链合成的。
3.PCR反应的开头两个循环和后面的循环是有所区别的，这个需要画个图才好说明，我就不画了，你可以尝试着自己画画。要是想不明白就不要追究了，知不知道这个对整个PCR没有什么影响。
4.用search找到引物的操作就是你截图的那样，要修改就用edit primer。就如你所说的，改了之后会有found，这个你自己衡量一下就好了，不必太在意。我设计过好多引物，极少碰到全部都是none的，一般都有三四个found，全部都found也有。引物设计多了你就会明白，引物好不好并不是由多少个none来确定的，而是由实验结果来定的。
5.最后一个问题是为什么人们会有不同的引物。因为不同的人会用不同的软件设计引物，不同的软件会有不同的评价方法，一个软件给出的引物在另一个软件看来未必是最优的。还有就是个人习惯不同也会把引物编辑得不一样，有些人还会根据自己实验的目的选用特殊的引物。

2014-02-08 21:34

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• 名侦探上线，看图猜罪犯血管——冠脉多支病变（结果公布在12楼）

faix

入门站友

热

2楼

qRT-PCR全称为实时定量荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。除了有荧光基团的参与外，qRT-PCR进行扩增的原理与普通PCR是完全一样的。
PCR反应需要两条引物，其中一条与扩增片段的互补，另一条与扩增片段的序列相同但与扩增片段的互补序列互补；所以只要确保两条引物之间的扩增序列正确，用mRNA序列或mRNA互补序列进行引物设计均可。但因为NCBI数据库中直接有mRNA的序列，所以直接用mRNA序列比较方便。
最后，其实对于qRT-PCR引物的设计还需要注意以下几点

扩增片段不能太长，最好在100-300bp之间；
为了防止基因组DNA的污染，必须使两条引物不能在同一个外显子内
（建议）最好是使用别人文献中报道过的qRT-PCR引物！推荐一个查找qRT-PCR引物的数据库——primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)

2014-02-06 16:34

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