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PCR技术

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论坛首页  >  PCR技术讨论版   >  引物设计
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【求助】primer5.0引物设计所用序列为什么是mRNA?

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楼主 tracy加油
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这个帖子发布于6年零354天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:5
做qRT-PCR时设计引物是直接将NCBI的mRNA区域中CDS区序列拷贝到primer5.0里面，可是做qRT-PCR前不是有一步是将RNA逆转录成cDNA吗？那以mRNA设计引物不是反了吗？我觉得是应该以mRNA的互补序列设计引物才对啊？请高人指点一下，谢谢！附图为人β-actin的mRNA的CDS区，好像设计引物就是把这段序列拷到primer5.0里
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2014-02-05 21:49 浏览 : 14020 回复 : 21
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elainechang 编辑于 2014-02-05 21:54
  • • 实话实说，非常典型的病例，走过路过，千万…别错过（手术，有结果）
faix
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qRT-PCR全称为实时定量荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。除了有荧光基团的参与外，qRT-PCR进行扩增的原理与普通PCR是完全一样的。
PCR反应需要两条引物，其中一条与扩增片段的互补，另一条与扩增片段的序列相同但与扩增片段的互补序列互补；所以只要确保两条引物之间的扩增序列正确，用mRNA序列或mRNA互补序列进行引物设计均可。但因为NCBI数据库中直接有mRNA的序列，所以直接用mRNA序列比较方便。
最后，其实对于qRT-PCR引物的设计还需要注意以下几点
  1. 扩增片段不能太长，最好在100-300bp之间；
  2. 为了防止基因组DNA的污染，必须使两条引物不能在同一个外显子内
  3. （建议）最好是使用别人文献中报道过的qRT-PCR引物！推荐一个查找qRT-PCR引物的数据库——primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)

    4. 希望我的回答对你有用。
2014-02-06 16:34
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楼主 tracy加油
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faix
qRT-PCR全称为实时定量荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。除了有荧光基团的参与外，qRT-PCR进行扩增的原理与普通PCR是完全一样的。
PCR反应需要两条引物，其中一条与扩增片段的互补，另一条与扩增片段的序列相同但与扩增片段的互补序列互补；所以只要确保两条引物之间的扩增序列正确，用mRNA序列或mRNA互补序列进行引物设计均可。但因为NCBI数据库中直接有mRNA的序列，所以直接用mRNA序列比较方便。
最后，其实对于qRT-PCR引物的设计还需要注意以下几点
  1. 扩增片段不能太长，最好在100-300bp之间；
  2. 为了防止基因组DNA的污染，必须使两条引物不能在同一个外显子内
  3. （建议）最好是使用别人文献中报道过的qRT-PCR引物！推荐一个查找qRT-PCR引物的数据库——primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)

    4. 希望我的回答对你有用。

非常感谢您的回答，我好像明白了，因为刚才上primerbank发现里面给出的三条引物都是上游引物和mRNA序列完全相同，而下游引物正好相反，所以应该就是您指的“其中一条与扩增片段的互补，另一条与扩增片段的序列相同但与扩增片段的互补序列互补”，但是我还是有一点不明白，为什么与mRNA序列相同的引物能够扩增呢？做PCR的引物不是也需要互补嘛？实在不好意思本人比较愚笨，可否麻烦您再解释一下啊？
2014-02-06 20:29
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qRT-PCR全称为实时定量荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。除了有荧光基团的参与外，qRT-PCR进行扩增的原理与普通PCR是完全一样的。
PCR反应需要两条引物，其中一条与扩增片段的互补，另一条与扩增片段的序列相同但与扩增片段的互补序列互补；所以只要确保两条引物之间的扩增序列正确，用mRNA序列或mRNA互补序列进行引物设计均可。但因为NCBI数据库中直接有mRNA的序列，所以直接用mRNA序列比较方便。
最后，其实对于qRT-PCR引物的设计还需要注意以下几点
  1. 扩增片段不能太长，最好在100-300bp之间；
  2. 为了防止基因组DNA的污染，必须使两条引物不能在同一个外显子内
  3. （建议）最好是使用别人文献中报道过的qRT-PCR引物！推荐一个查找qRT-PCR引物的数据库——primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)

    4. 希望我的回答对你有用。
哦，我想明白了，但是还有一个问题是关于软件设计引物的：
1、search primer和自己在direct select框里自己一个个从前往后筛选择是不是一样啊？为什么我用search按钮找到的排名最前的引物（几乎处于核苷酸链靠后的位置）结果分析几乎都是none，没有found，但是关闭search当自己重新把鼠标点在direct select核苷酸链的相应位置时就又

变成了“found”？同样的位置为什么用search出来就没有found呢？
2、search为什么一定要选pairs?选择sense 和 anti-sense不是也表示分别找上下游引物吗？而且pairs好像也只出现了一个引物啊，不知道是代表上游还是下游啊？
2014-02-06 23:16
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