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植物与农林科学

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【求助】PCR产物纯化酶切，切不动

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楼主

常驻站友

1楼

这个帖子发布于5年零258天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

最近构建载体，发现载体构建不成功的问题——PCR产物酶切不动，真诚求助各位大神怎么解决？
本人将pCAMBIA1301载体用Fermentas的EcoRI和NcoI酶切后，能切出800bp的目的条带，也用同样的酶和buffer切PCR产物（已纯化），后连接转化，多次不成功，也是醉了。于是怀疑PCR产物没被切动，便将载体酶切后分别胶回收和纯化（纯化的含有800bp片段），以摩尔比5:1比例添加酶切后PCR产物和胶回收及纯化后的酶切载体，连接转化后载体纯化的那一份长出了很多斑（感受态没问题，检测均为空载），但胶回收的没有长斑，于是就得出PCR产物未被酶切导致实验失败的结论。但不知如何解决这一问题，请问如何解决PCR产物充分酶切？

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2014-11-21 14:51 浏览 : 2552 回复 : 8

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• 通过了副高考试，要经历多久才能真正成为副高？

楼主

常驻站友

2楼

付：引物设计时两个酶切位点都添加了保护碱基，先前也用相同的保护碱基序列成功构建了载体。引物合成单上的序列也与我设计序列相同。高保真PCR产物2管纯化后取20uL，ddH2O 20uL，buffer 5uL，EcoRI和NcoI各2.5uL，混合后37℃ 水浴2.5h孵育。

2014-11-21 15:01

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• 医生医学生必学系列：肺窗 CT 应该怎么看？

常驻站友

3楼

检查下PCR片段中有没有这两个酶切位点（酶切后跑个电泳看看切后的条带有没有变化）
可以将酶切后的PCR片段送测序，看看末端是不是真的没切开

2015-01-10 15:37

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• 美国首位“换脸”女性去世，曾为获新生接受30次手术

丁香园版主

4楼

diaosihu
付：引物设计时两个酶切位点都添加了保护碱基，先前也用相同的保护碱基序列成功构建了载体。引物合成单上的序列也与我设计序列相同。高保真PCR产物2管纯化后取20uL，ddH2O 20uL，buffer 5uL，EcoRI和NcoI各2.5uL，混合后37℃ 水浴2.5h孵育。

现在才看到这个帖子，酶切质粒能切开说明限制性内切酶没有问题。
一个问题，你当初切质粒的时候也是用这么多酶吗？个人认为已经是太多了，各加1 微升应该足够了。
另外一个就是，在纯化的产物上加A，然后链接T载体，再酶切，虽然烦琐点，但有时值得尝试。

2015-01-10 20:58

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