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【原创】应用ImageJ对荧光图片进行半定量分析 [精华]

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楼主

空山凝烨

妇产科

丁香园准中级站友

+1 积分
1楼

这个帖子发布于5年零256天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

前言
ImageJ是个好东西……（省略1000字）
总地来说对我们的好处是：
1、免费
2、多功能，基本功能就很多，加上插件可以说得上是无限多（前提是你找得到，而且会用），真的没有的功能还能自己做个插件（一般我们倒是没这个闲功夫，基本好插件都是老外做出来的）
3、分析处理的结果比较受到普遍承认
这里是它的官网：
http://imagej.nih.gov/ij/
官网有它的原版安装包及大量插件、用户手册下载

正题
1、安装后首先打开ImageJ：
2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O）

3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit

4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I）

以下为从左到右分别为原图、8bit灰度图及反转后的图：

5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate

在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK

点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：

如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages

6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale

点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK

7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements

在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold（这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK

8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T）

滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set

在弹出来的界面点击OK

9、测量：Analyze>Measure（热键为Ctrl+M或直接按M）

10、记录数据并计算：

结果中的Area为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积；IntDen就是所选范围的IOD（光密度的总和）。
结果界面中的数据可以复制到Excel等软件中进行计算。
用IntDen的数值除以Area的数值得出来的就是这张图片中细胞的平均光密度，以这张图片的数据为例，即：18854/179252=0.105181532（/pixel）
同法测量多张图的平均光密度值后就可以进行半定量比较。

以下附上分别应用Image-Pro Plus及ImageJ对五张图片进行分析的结果对比：

从结果的对比看来ImageJ与IPP（Image-Pro Plus）的分析结果是基本一致的

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2013-05-06 12:48 浏览 : 204063 回复 : 267

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空山凝烨编辑于 2013-05-06 14:07

• 束昱辉等16人被批捕

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aazhou3126

常驻站友

热

121楼

@空山凝烨：非常感谢您的无私奉献，简单明了，受益良多。想问您一下：这个最后算出来的细胞的平均光密度是不是文献中统计用的柱状图纵坐标：intensity? 我看文献（如下图右侧ROS统计图）的这个坐标值好像都在1以上，我们的大概是0.02-0.2左右，是不是表示百分的意思，那么，0.02即为2%，作图的时候纵坐标即为2？有点困惑，请您解惑，谢谢啦！

2016-03-03 15:59

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闵丁香1989

常驻站友

88楼

楼主，你好，非常感谢您的分享。有几个问题想请教：
1. 步骤上说的滑动滑块选中区域，这个地方不是很明白到底是什么意思。我滑动了滑块，没发现有选中的区域啊。
2.我在另外一个地方看到一个帖子，操作如下：
a| 打开Image J软件，
|b| 在此软件里打开一个免疫组化或荧光显微镜的照片，
|c| 将图片类型改为灰度（32-bit），
|d| 调出ROI工具 Analyze → Tools → ROI manager，
|e| 将要分析的区域选中，加入到ROI （Add），
|f| 如有多个区域，可重复e，
|g| 点击Measure即可测得具体数值。
按照这个步骤我也能测量结果，但是不知这种方法对否？

2014-11-07 13:58

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• 阑尾炎要了他的命

楼主

空山凝烨

妇产科

丁香园准中级站友

热

32楼

daisyrong0108
你好呀，我用你的这个步骤去计算的。我的荧光弱的图片的细胞明显多于荧光强的图片，threshold调一样大的时候计算出来的area却是荧光强的图片大，这是为什么呢？还有不同图片，threshold应该是调一样的吗？

你最好把图发上来看看，光是描述的话有时不太好找原因
阈值的话，其实就是说某个强度以上的荧光纳入计算范围
这个界线在最理想的情况介于应该是最弱的有意义的荧光和背景之间
实际操作上有时不一定能完全做得到，我个在实际使用中的原则就是尽量少选背景的前提下，把阈值尽量拉大一点
同一次实验中，如果各图片的拍摄条件都一样的情况，理论上这个阈值是一样的
但是即使放大倍数，曝光时间等一致的情况下，你实际拍摄的时间也会有一点差别
比如说这张图，你可能是打开激发光的同时就拍了，另一张图你是打开激发光1秒之后才拍
这样两张图就会有差异，当然只要实际上差得不是很多，那就不要紧了
何况后面还有统计学分析呢

2014-04-19 14:55

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