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【原创】应用ImageJ对荧光图片进行半定量分析 [精华]

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楼主

空山凝烨

丁香园准中级站友

+1 积分
1楼

这个帖子发布于4年零53天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

前言
ImageJ是个好东西……（省略1000字）
总地来说对我们的好处是：
1、免费
2、多功能，基本功能就很多，加上插件可以说得上是无限多（前提是你找得到，而且会用），真的没有的功能还能自己做个插件（一般我们倒是没这个闲功夫，基本好插件都是老外做出来的）
3、分析处理的结果比较受到普遍承认
这里是它的官网：
http://imagej.nih.gov/ij/
官网有它的原版安装包及大量插件、用户手册下载

正题
1、安装后首先打开ImageJ：
2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O）

3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit

4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I）

以下为从左到右分别为原图、8bit灰度图及反转后的图：

5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate

在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK

点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：

如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages

6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale

点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK

7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements

在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold（这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK

8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T）

滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set

在弹出来的界面点击OK

9、测量：Analyze>Measure（热键为Ctrl+M或直接按M）

10、记录数据并计算：

结果中的Area为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积；IntDen就是所选范围的IOD（光密度的总和）。
结果界面中的数据可以复制到Excel等软件中进行计算。
用IntDen的数值除以Area的数值得出来的就是这张图片中细胞的平均光密度，以这张图片的数据为例，即：18854/179252=0.105181532（/pixel）
同法测量多张图的平均光密度值后就可以进行半定量比较。

以下附上分别应用Image-Pro Plus及ImageJ对五张图片进行分析的结果对比：

从结果的对比看来ImageJ与IPP（Image-Pro Plus）的分析结果是基本一致的

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2013-05-06 12:48 浏览 : 67263 回复 : 197

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空山凝烨 edited on 2013-05-06 14:07

• 肝脏占位2

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自由行走的花儿

入门站友

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3楼

很感谢楼主无私的分享。我还有个问题，我想知道这个可以用来分析一组图片中的每个细胞的荧光亮度，并画出曲线图吗？我是实时监测细胞荧光亮度变化的。就像下面的图像中的神经元，能测量吗？先谢谢楼主

2013-05-19 11:38

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daisyrong0108

入门站友

30楼

你好呀，我用你的这个步骤去计算的。我的荧光弱的图片的细胞明显多于荧光强的图片，threshold调一样大的时候计算出来的area却是荧光强的图片大，这是为什么呢？还有不同图片，threshold应该是调一样的吗？

2014-04-17 15:38

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只是心字已成灰

入门站友

10楼

第一次接触这个软件，之前有向别人请教过这个软件，但是为什么说是把荧光强度转化为白底背景下的灰度值，然后来测灰度值什么的，也没有说要校正成uncalibrate OD，还有就是在调整阈值的时候，那步你点出来是红色的图片的那张，为什么我点出来就是黑白图片。对这个软件了解很少，提的问题可能有点奇怪，希望能回复。。

2013-08-17 12:59

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huiyuan02

入门站友

2楼

认真学习了，正需要，非常感谢楼主！

2013-05-14 12:03

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• 高中毕业想学医

自由行走的花儿

入门站友

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3楼

2013-05-19 11:38

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楼主

空山凝烨

丁香园准中级站友

4楼

自由行走的花儿
很感谢楼主无私的分享。我还有个问题，我想知道这个可以用来分析一组图片中的每个细胞的荧光亮度，并画出曲线图吗？我是实时监测细胞荧光亮度变化的。就像下面的图像中的神经元，能测量吗？先谢谢楼主

测单个细胞是吧？操作有点复杂就是了

2013-05-19 12:31

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楼主

空山凝烨

丁香园准中级站友

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5楼

前面步骤是一样的
选择好域值之后，再用选择工具把你要的单个细胞圈选出来

4种圈选工具外加魔术棒都可以，各有各的特点，按具体需要选用，一般矩形选择就够用了
圈选好细胞后同样在Analyze>Measure命令里测量，测出来的就是圈选中的细胞的数据了

后面的计算方法也是一样的
同法重复测量完后，你就可以把数据弄到excel或软件里作图或作统计学处理了

2013-05-19 12:48

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自由行走的花儿

入门站友

6楼

先感谢下

因为我每次都是实时监测，一般都排了大概300张这能不能连续自动分析一个细胞的荧光亮度，然后直接得出一个变化曲线。
还有就死阈值设了有什么用

2013-05-19 14:06

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• 医学（临床）考研各种套路

楼主

空山凝烨

丁香园准中级站友

7楼

自由行走的花儿
先感谢下因为我每次都是实时监测，一般都排了大概300张这能不能连续自动分析一个细胞的荧光亮度，然后直接得出一个变化曲线。
还有就死阈值设了有什么用

可以制作一个宏来自动重复这些操作，但是实质应用中个人觉得不是非常理想，当然也可能是因为我对宏的应用还不够了解，总之就是我还没有很好的方法解决这个问题
再说一下，我一般一次是分析60张图片，熟练之后加上多用热键大概要半个小时，这样的话
设阈值是为了“只选中细胞作来测量”，比方说某些染料会被细胞排出胞外，而胞内的染料才是我们想测量的，在这种情况下不设阈值的话测量的结果就完全不对了；还有，我们要计算的一般是细胞（或目的区域）的平均的荧光情况，而不是整张图片，如果不设阈值就变成整张图片的平均荧光的水平了

2013-05-19 17:37

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• 晒一波复旦录取通知书

御虚乘风

入门站友

8楼

楼主教程很详细易懂，在看了N多个简化难懂的教程后终于看到这个了，真的十分感谢。

2013-07-29 12:17

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• 安徽省规培考试2017试卷回忆版

hbchendl

丁香园准中级站友

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9楼

自由行走的花儿
先感谢下因为我每次都是实时监测，一般都排了大概300张这能不能连续自动分析一个细胞的荧光亮度，然后直接得出一个变化曲线。
还有就死阈值设了有什么用

这事儿可以这样作：
http://www.tudou.com/listplay/XxZ0uHvuBMs/WbwUj-1vYDQ.html

2013-07-29 12:33

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• 肝脏占位

只是心字已成灰

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10楼

2013-08-17 12:59

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楼主

空山凝烨

丁香园准中级站友

11楼

只是心字已成灰
第一次接触这个软件，之前有向别人请教过这个软件，但是为什么说是把荧光强度转化为白底背景下的灰度值，然后来测灰度值什么的，也没有说要校正成uncalibrate OD，还有就是在调整阈值的时候，那步你点出来是红色的图片的那张，为什么我点出来就是黑白图片。对这个软件了解很少，提的问题可能有点奇怪，希望能回复。。

灰度值也不是不可以，但是相对来说没这么准确度确，详情可参考楼上所写的IPP系列教学帖，我也是从那些教学帖里参考了不少知识
默认好像是黑白的，我自己选成红色的，这个是可以自己行选择的，关键还是阈值的数值，什么颜不影响结果的

2013-08-18 00:37

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• 一张有意思的CT

只是心字已成灰

入门站友

12楼

空山凝烨
灰度值也不是不可以，但是相对来说没这么准确度确，详情可参考楼上所写的IPP系列教学帖，我也是从那些教学帖里参考了不少知识
默认好像是黑白的，我自己选成红色的，这个是可以自己行选择的，关键还是阈值的数值，什么颜不影响结果的

恩，好的，我再试一下，谢谢！

2013-08-19 17:05

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• 肝脏占位2

dolphin601

入门站友

13楼

感谢楼主，好东西分享，初学菜鸟受益匪浅

2014-01-27 11:37

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doctor_wqs

分子生物学实验室

常驻站友

14楼

很感谢楼主的经验分享。

2014-01-29 08:53

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qq6108

丁香园准中级站友

15楼

很有用

2014-02-08 15:55

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houleone

入门站友

16楼

真心非常棒的教程，感谢LZ！

2014-02-15 19:44

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• 香港城市大学郭駿傑研究组博士生招收启事

liangyan_100

入门站友

17楼

非常实用，我问了好几个同学都不知道，还是这里的知识广泛啊。谢谢楼主

2014-02-25 14:59

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• 丁香园普外版病例挑战（六月活动一、积分叮当奖励）

cherryq712

神经科

入门站友

18楼

非常有用！！言简意赅！！楼主大侠啊~~

2014-03-17 21:07

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• 肝脏占位

一天txn

入门站友

19楼

如果是免疫荧光双标的图片是否也可以用这个半定量分析？谢谢

2014-03-24 19:13

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• 肝脏占位1

楼主

空山凝烨

丁香园准中级站友

20楼

一天txn
如果是免疫荧光双标的图片是否也可以用这个半定量分析？谢谢

可以，两种荧光分别分析

2014-03-24 21:14

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• 高中毕业想学医

一天txn

入门站友

21楼

可是我要看的是最终两种蛋白免疫荧光共表达的结果，不能拿最后的片子分析吗？有没有相关的文献，求助一篇啊，谢谢。

2014-03-26 08:31

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楼主

空山凝烨

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22楼

一天txn
可是我要看的是最终两种蛋白免疫荧光共表达的结果，不能拿最后的片子分析吗？有没有相关的文献，求助一篇啊，谢谢。

不行，要分开分析再综合起来看

2014-03-26 09:25

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• 【原创】急诊故事:《车裂》

一天txn

入门站友

23楼

请问我这种怎样才能变成你那种只选中细胞的图像，设定阈值吗？我要怎样设定阈值呐？请指点一下，非常感谢啊。

2014-03-27 18:20

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空山凝烨

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24楼

一天txn
请问我这种怎样才能变成你那种只选中细胞的图像，设定阈值吗？我要怎样设定阈值呐？请指点一下，非常感谢啊。

方法是一样的，关键在于尽量不选背景，尽量多选目的区域
不过你这图看起来有点问题啊，左侧那里

2014-03-28 22:43

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可洛卡

检验科

入门站友

25楼

太给力了　好好学习一下　一直没有找到这么的详细的解释　真心感谢楼主哈　大家顶一个哈

2014-04-06 14:19

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• 高中毕业想学医

可洛卡

检验科

入门站友

26楼

我想再请教一个问题哈　就是我想比较不同处理组间的荧光强度　那么需要把哪些变量调成一致才有比较意义呢　谢谢

2014-04-06 15:31

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• 高中毕业想学医

01happy03

常驻站友

27楼

非常感谢楼主的解释，感觉对这个软件的操作清晰明了了许多，但仍有问题想请教楼主。
1. 我做的是组织切片的免疫组化，在分析的过程中我想应该只需要进行灰度图的转换而不需要进行像荧光那样的黑白反转，不知道这一点我理解是否正确？另外8位与16位的灰度转换有什么区别么？
2. 在分析过程中发现，在调整阈值以选取自己想要测定的目标区域时，周围某些非目标区域也会有被部分选上的情况，请问楼主这种情况要怎么避免呢？或者说是否有可以直接选定自己想要测的区域呢？因为毕竟免疫组化的显色区域并不规则，使用魔术手时总是不能选到我想要的区域。
如图所示：右侧的那个伸出去的横向的条带是我不想要测的，怎么排除掉呢？

多谢楼主!

2014-04-07 01:34

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空山凝烨

丁香园准中级站友

28楼

01happy03
非常感谢楼主的解释，感觉对这个软件的操作清晰明了了许多，但仍有问题想请教楼主。
1. 我做的是组织切片的免疫组化，在分析的过程中我想应该只需要进行灰度图的转换而不需要进行像荧光那样的黑白反转，不知道这一点我理解是否正确？另外8位与16位的灰度转换有什么区别么？
2. 在分析过程中发现，在调整阈值以选取自己想要测定的目标区域时，周围某些非目标区域也会有被部分选上的情况，请问楼主这种情况要怎么避免呢？或者说是否有可以直接选定自己想要测的区域呢？因为毕竟免疫组化的显色区域并不规则，使用魔术手时总是不能选到我想要的区域。
如图所示：右侧的那个伸出去的横向的条带是我不想要测的，怎么排除掉呢？

多谢楼主!

1、组化的图不需要反转。8bit和16bit的差别我也不能完全说得清楚，从分析结果上看，16bit的数值更大，但是趋势是一样的。我的理解是这样，8bit相当于级别比较少，比如说只分好人和坏人，16bit级别比较多，分好人，一般人坏人。如果想比较更细微的差异时，可能16bit更好一些，选8bit的话，你可能把一般人都分到坏人里面去了，有的差异就体现不出来了
2、最好的办法就是拍照前调整好白平衡，片子做得干净点。如果还不行的话，像楼主这种比较集中非目标区域的可以把那部分切掉，如果是小点的话可以选择直径小于XX以下的不选中，直接选自己要的区域也行，不过太主观了，结果很可能不太客观

2014-04-07 17:33

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• 香港城市大学郭駿傑研究组博士生招收启事

mybbff

丁香园荣誉版主

29楼

点个赞！学习一下！

2014-04-07 22:11

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• 高中毕业想学医

daisyrong0108

入门站友

30楼

2014-04-17 15:38

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• 2017南大申请考核成功的一点体会

路漫漫xh

入门站友

31楼

您好，我也在这里学习了这些知识，也遇到了和楼上一样的问题呢，依据上面的操作，图片反转后，荧光较强的细胞算出来的强度值反而更小（强度=图片的像素面积*图片平均光密度/AOI像素面积），就不知道这个该怎样理解了？？我也是在网上看到的，不知道这样算对不对? 想请教楼主，谢谢

2014-04-18 22:21

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• 人在路上，路在前方——记考博，求职，申请留学经历

楼主

空山凝烨

丁香园准中级站友

32楼

daisyrong0108
你好呀，我用你的这个步骤去计算的。我的荧光弱的图片的细胞明显多于荧光强的图片，threshold调一样大的时候计算出来的area却是荧光强的图片大，这是为什么呢？还有不同图片，threshold应该是调一样的吗？

你最好把图发上来看看，光是描述的话有时不太好找原因
阈值的话，其实就是说某个强度以上的荧光纳入计算范围
这个界线在最理想的情况介于应该是最弱的有意义的荧光和背景之间
实际操作上有时不一定能完全做得到，我个在实际使用中的原则就是尽量少选背景的前提下，把阈值尽量拉大一点
同一次实验中，如果各图片的拍摄条件都一样的情况，理论上这个阈值是一样的
但是即使放大倍数，曝光时间等一致的情况下，你实际拍摄的时间也会有一点差别
比如说这张图，你可能是打开激发光的同时就拍了，另一张图你是打开激发光1秒之后才拍
这样两张图就会有差异，当然只要实际上差得不是很多，那就不要紧了
何况后面还有统计学分析呢

2014-04-19 14:55

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• 发个帖子，聊聊技能考的怎么样(言之有物者有加分）

楼主

空山凝烨

丁香园准中级站友

33楼

路漫漫xh
您好，我也在这里学习了这些知识，也遇到了和楼上一样的问题呢，依据上面的操作，图片反转后，荧光较强的细胞算出来的强度值反而更小（强度=图片的像素面积*图片平均光密度/AOI像素面积），就不知道这个该怎样理解了？？我也是在网上看到的，不知道这样算对不对? 想请教楼主，谢谢

1、最好能上图，这样比较好解释
2、我的理解是荧光的强度＝图片中荧光的总光密度/荧光的总面积

2014-04-19 14:57

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• 2017南大申请考核成功的一点体会

路漫漫xh

入门站友

34楼

B
这是两张图，肉眼可见荧光强度有挺大的区别的，“ 我的理解是荧光的强度＝图片中荧光的总光密度/荧光的总面积”，我设的阈值是lower threshold(2.71),upper threshold(0.10) ,算出来的结果怪怪的，麻烦楼主指导下，不胜感激。

2014-04-19 17:21

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daisyrong0108

入门站友

35楼

谢谢你呀！我后来试了下，把阈值拉到暗的那张图的面积都看到就可以了呢。原先是阈值太高了，暗的那张面积都没有算到。

2014-04-21 15:26

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daisyrong0108 edited on 2014-04-21 15:43

• 丁香园版主力作《心血管内科医生成长手册》(人卫出版)有奖问答活动开始了！25 本图书等你来拿！

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