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【原创】应用ImageJ对荧光图片进行半定量分析 [精华]

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楼主

空山凝烨

妇产科

丁香园准中级站友

+1 积分
1楼

这个帖子发布于6年零199天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

前言
ImageJ是个好东西……（省略1000字）
总地来说对我们的好处是：
1、免费
2、多功能，基本功能就很多，加上插件可以说得上是无限多（前提是你找得到，而且会用），真的没有的功能还能自己做个插件（一般我们倒是没这个闲功夫，基本好插件都是老外做出来的）
3、分析处理的结果比较受到普遍承认
这里是它的官网：
http://imagej.nih.gov/ij/
官网有它的原版安装包及大量插件、用户手册下载

正题
1、安装后首先打开ImageJ：
2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O）

3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit

4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I）

以下为从左到右分别为原图、8bit灰度图及反转后的图：

5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate

在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK

点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：

如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages

6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale

点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK

7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements

在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold（这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK

8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T）

滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set

在弹出来的界面点击OK

9、测量：Analyze>Measure（热键为Ctrl+M或直接按M）

10、记录数据并计算：

结果中的Area为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积；IntDen就是所选范围的IOD（光密度的总和）。
结果界面中的数据可以复制到Excel等软件中进行计算。
用IntDen的数值除以Area的数值得出来的就是这张图片中细胞的平均光密度，以这张图片的数据为例，即：18854/179252=0.105181532（/pixel）
同法测量多张图的平均光密度值后就可以进行半定量比较。

以下附上分别应用Image-Pro Plus及ImageJ对五张图片进行分析的结果对比：

从结果的对比看来ImageJ与IPP（Image-Pro Plus）的分析结果是基本一致的

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2013-05-06 12:48 浏览 : 271960 回复 : 323

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空山凝烨编辑于 2013-05-06 14:07

• 340万人考研？跟去年预估的350万差不多，国家线310分应该是没跑了

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aazhou3126

常驻站友

热

121楼

@空山凝烨：非常感谢您的无私奉献，简单明了，受益良多。想问您一下：这个最后算出来的细胞的平均光密度是不是文献中统计用的柱状图纵坐标：intensity? 我看文献（如下图右侧ROS统计图）的这个坐标值好像都在1以上，我们的大概是0.02-0.2左右，是不是表示百分的意思，那么，0.02即为2%，作图的时候纵坐标即为2？有点困惑，请您解惑，谢谢啦！