发帖
每发1个新帖
可以获得0.5个丁当奖励
回帖

【实验求助】Annexin V/PI双染后流式检测结果解读

只看楼主
页码直达：
直达末页

楼主

gwbeef

心血管内科

常驻站友

1楼

这个帖子发布于7年零79天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

问题已解决悬赏丁当:2

1、细胞分离培养
原代SD乳鼠心肌细胞分离，培养48h（10%血清+常糖培养基）后，饥饿12h（常糖培养基）。
2、缺氧复氧处理
对照组：培养24h（常糖培养基）。
处理组：缺氧4h（无糖培养基），复氧20h（常糖培养基）。
3、Annexin V/PI双染流式检测
收集上清液到15ml离心管
0.25%胰酶（不含EDTA）消化，血清中止，收集到上面的离心管
离心（1000转、5min），PBS重悬
用冰盒运输（20min路程），到那边的流式检测室染Annein V/PI，然后上机检测
4、结果
第一幅图是空白对照（消除自身荧光）
A1、B1、C1为对照组，A2、B2、C2为处理组

问题：
1、凋亡率的计算是LR还是LR+UR？
2、对照组：常糖培养基（不加血清）培养36h（12h饥饿+24h对照时间），凋亡率会这么高吗？
3、这个结果是不是存在假阳性？如何控制？缩短胰酶消化时间？（我是胰酶消化观察到细胞松动后，用移液*吹打3次）
4、能不能用TUNEL检测？见过相关文献报道过，不过个人认为TUNEL主观性太强。但Annexin/PI处理贴壁细胞，假阳性不可避免，重复性差。或者其他方法推荐
5、如果这个结果没问题，那我是不是要缩短复氧时间？这样可以检测更多的早期凋亡，同时减少晚期凋亡率。
6、常糖培养基加入血清，会不会减少对照组的凋亡率？
望各位战友出谋献策，谢谢！

邀请讨论

搜索

2013-04-27 20:25 浏览 : 5698 回复 : 6

投票
收藏 22
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 饶毅顶刊发文，公开质疑上海药物所耿美玉团队文章！

dawnmed

肿瘤外科

丁香园准中级站友

+1 积分
2楼

gwbeef
1、细胞分离培养
原代SD乳鼠心肌细胞分离，培养48h（10%血清+常糖培养基）后，饥饿12h（常糖培养基）。
2、缺氧复氧处理
对照组：培养24h（常糖培养基）。
处理组：缺氧4h（无糖培养基），复氧20h（常糖培养基）。
3、Annexin V/PI双染流式检测
收集上清液到15ml离心管
0.25%胰酶（不含EDTA）消化，血清中止，收集到上面的离心管
离心（1000转、5min），PBS重悬
用冰盒运输（20min路程），到那边的流式检测室染Annein V/PI，然后上机检测
4、结果
第一幅图是空白对照（消除自身荧光）
A1、B1、C1为对照组，A2、B2、C2为处理组


问题：
1、凋亡率的计算是LR还是LR+UR？
2、对照组：常糖培养基（不加血清）培养36h（12h饥饿+24h对照时间），凋亡率会这么高吗？
3、这个结果是不是存在假阳性？如何控制？缩短胰酶消化时间？（我是胰酶消化观察到细胞松动后，用移液*吹打3次）
4、能不能用TUNEL检测？见过相关文献报道过，不过个人认为TUNEL主观性太强。但Annexin/PI处理贴壁细胞，假阳性不可避免，重复性差。或者其他方法推荐
5、如果这个结果没问题，那我是不是要缩短复氧时间？这样可以检测更多的早期凋亡，同时减少晚期凋亡率。
6、常糖培养基加入血清，会不会减少对照组的凋亡率？
望各位战友出谋献策，谢谢！

你好，对于你的问题我可以解答一部分
1.凋亡细胞就是LR+UR，LR代表早期凋亡，UR代表晚期凋亡的细胞，LL是活细胞，UL是坏死损伤的细胞。
4. TUNEL确实主观性很大，不过如果实验组和对照组凋亡率差别很大的话可以用作定性的一个比较。我之前也是做凋亡，我还做了一个caspase-3的western，个人理解TUNNEL到ANEXIN V/PI再到caspase-3是一个由定性到定量再到机制逐渐深入的过程。当然其他的一些凋亡相关蛋白比如Bax和Bcl-2也可以酌情选择测量。
只能回答这么多，希望对你有帮助。

2013-04-28 09:04

投票 4
收藏 4
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 2020 执业医师技能考试，你们考执业医师都是怎么过的？你考了多少分？

lxw245

全科

铁杆站友

+1 积分
3楼

ANEXIN V/PI是活细胞染色，最理想的是用于悬浮细胞的染色，对于贴壁培养的细胞用这种方法检测其实是存在很大操作误差的，但又是无法避免的事实。如果你对研究很认真的话，用这种方法检测确实不是理想中的那么优美，个人对这种方法做了很久，对其中的艰难深有体会。ANEXIN V/PI检测贴壁细胞最关键的环节是胰酶消化处理的过程，该环节做的不好，就会大大增加实验的假阳性，也会使早期凋亡细胞转变为晚期凋亡细胞。另外，用这种方法检测，一定要严格控制细胞染色到上机检测的时间间隔，否则也会增加假阳性结果。总之，用这种方法，要做到好而精确，确实不容易！个人建议，检测凋亡，为了使结果客观，还是结合多种方法比较好，不要过度依赖某一方法的检测结果，最好是几种方法的综合分析可靠。

2013-04-29 21:48

投票 2
收藏 3
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 形似而神不似之胸闷

reyesa

丁香园准中级站友

+1 积分
4楼

满意答案

你的这个对照的图细胞有点像坏死而不是凋亡的。
心肌细胞好像贴壁以后很难消化下来。也许状态好的细胞没消化下来。
所以流式不一定是最好的方法
如果想做凋亡，最好用caspase3的剪切抗体做免疫荧光，dapi复染之后计数100个dapi的核里ca3阳性的数量
TUNEL是不管凋亡还是坏死的。可以用来测cell death。方法与c3的一样。也是可以认可的。
这些也是标准的方法。
如果一定要做流式，建议测一下培养48小时的**-PI。看看坏死的多不多。
其实可以先标上**，在送过去。路上20分钟刚好用来标记。不知道你的PI是不是处理时间太长。

2013-05-02 22:48

投票 3
收藏 5
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 【心力憔悴】胸痛的37岁男子，中奖了！（07.05已补充资料）

细胞学与信号转导

【实验求助】Annexin V/PI双染后流式检测结果解读

提示

丁香园旗下网站

关于丁香园

官方链接

细胞学与信号转导

分享到：

微信扫一扫

【实验求助】Annexin V/PI双染后流式检测结果解读

微信扫一扫

微信扫一扫

微信扫一扫

微信扫一扫

提示

丁香园旗下网站

关于丁香园

官方链接