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【交流】以pGL3basic构建plasmid,久不成功

发布于 2012-07-09 · IP 重庆重庆
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这个帖子发布于 13 年零 134 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大神:
构建载体2月有余,迟迟不成功,焦头乱额。实验是将一段promoter连接到pGL3basic,具体方法:
1. PCR 得到DNA ,电泳并胶回收。
2 .将PCR products(约4kb) 和载体pGL3basic(promega) 用相同的酶分别进行酶切,pGL3basic酶切后加磷酸酶(CIAP,invitrogen),并胶回收(Gel-extraction kit from AXYGEN)。
3.将酶切胶回收后的PCR products 和pGL3basic 进行连接反应(连接酶:solution1,takara),转化到LB平板
4.挑克隆并鉴定。
2个月都没筛选出阳性克隆。主要问题:
1.胶回收效率不高,那位大神用过比较好的回收试剂盒,请推荐。
2.连接体系已经尝试过多种,1:3-1:10(VECTOR/insert)
先谢谢各位宝贵的意见,需要注意和改进的细节。








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