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动物与组织学技术

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论坛首页  >  实验动物与组织学技术讨论版   >  【实验动物】
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【求助】奇怪的genotyping 结果?求助!

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楼主 asdqwe12345
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这个帖子发布于7年零156天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人 菜鸟,现在正养着一种基因敲除鼠,按照genotyping protocols的引物,剪尾巴提取DNA鉴定出了KO和WT,然后又分离了脾脏提取RNA,再用RT-PCR,和普通的引物来检查敲除的效果,结果发现无论是WT还是KO还都表达那个敲掉的基因,好困惑啊!

向各位高手求助!
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2012-07-06 17:38 浏览 : 3065 回复 : 3
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dong862242
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表达那个基因是正常,KO鼠一般只是敲出某些外显子,而并不是完全敲出这个基因,顺便问下楼主:最近我提取小鼠DNA不是很稳定,请问你是采用什么方法提取mouse tail DNA?
2012-07-07 18:01
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楼主 asdqwe12345
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dong862242
表达那个基因是正常,KO鼠一般只是敲出某些外显子,而并不是完全敲出这个基因,顺便问下楼主:最近我提取小鼠DNA不是很稳定,请问你是采用什么方法提取mouse tail DNA?

抱歉,我没有说清楚,我的小鼠是插入失活。但是普通PCR是否也只是P出了其中的一个外显子,是否一定要WB或者ELISA才能确定。
我用的提取方法:

剪取出生后10d左右的小鼠尾尖0.5-1.0cm置于1.5ml EP管中
提取基因组DNA方法:
?每管加200μl组织裂解液,于56℃保温过夜
?每管加100μl饱和NaCl( 6mol/L )
?将EP管置于纸盒中剧烈振荡200次以上
?置于冰上20min
?14000rpm,离心10min(RT)
?吸上清156μl置干净EP管中,每管加250μl无水乙醇,颠倒混匀
?14000rpm,离心10min(RT)
?弃上清,室温干燥,每管加30μl -50μlTE,37℃保温至DNA完全溶解
组织裂解液配方: (0.5% SDS,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L EDTA,0.01mol/L Tris?Cl PH8.0)100μg/ml 蛋白酶 K
2012-07-07 20:44
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dong862242
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就是你鉴定KO鼠的引物是针对你插入的序列,如果你PCR条件特异,一般P出来就是KO。如果你每只老鼠都做Western就太麻烦了,我现在也在做基因型的鉴定,就仅仅用PCR鉴定
2012-07-08 19:17
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