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动物与组织学技术

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论坛首页  >  实验动物与组织学技术讨论版   >  【实验动物】
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【求助】奇怪的genotyping 结果？求助！

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楼主 asdqwe12345
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这个帖子发布于7年零156天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人 菜鸟，现在正养着一种基因敲除鼠，按照genotyping protocols的引物，剪尾巴提取DNA鉴定出了KO和WT，然后又分离了脾脏提取RNA，再用RT-PCR，和普通的引物来检查敲除的效果，结果发现无论是WT还是KO还都表达那个敲掉的基因，好困惑啊！

向各位高手求助！
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2012-07-06 17:38 浏览 : 3065 回复 : 3
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dong862242
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表达那个基因是正常，KO鼠一般只是敲出某些外显子，而并不是完全敲出这个基因，顺便问下楼主：最近我提取小鼠DNA不是很稳定，请问你是采用什么方法提取mouse tail DNA？
2012-07-07 18:01
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楼主 asdqwe12345
asdqwe12345
常驻站友

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dong862242
表达那个基因是正常，KO鼠一般只是敲出某些外显子，而并不是完全敲出这个基因，顺便问下楼主：最近我提取小鼠DNA不是很稳定，请问你是采用什么方法提取mouse tail DNA？

抱歉，我没有说清楚，我的小鼠是插入失活。但是普通PCR是否也只是P出了其中的一个外显子，是否一定要WB或者ELISA才能确定。
我用的提取方法：

剪取出生后10d左右的小鼠尾尖0.5－1.0cm置于1.5ml EP管中
提取基因组DNA方法：
?每管加200μl组织裂解液，于56℃保温过夜
?每管加100μl饱和NaCl（ 6mol/L ）
?将EP管置于纸盒中剧烈振荡200次以上
?置于冰上20min
?14000rpm，离心10min（RT）
?吸上清156μl置干净EP管中，每管加250μl无水乙醇，颠倒混匀
?14000rpm，离心10min（RT）
?弃上清，室温干燥，每管加30μl －50μlTE，37℃保温至DNA完全溶解
组织裂解液配方： （0.5％ SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L EDTA，0.01mol/L Tris?Cl PH8.0）100μg/ml 蛋白酶 K
2012-07-07 20:44
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dong862242
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就是你鉴定KO鼠的引物是针对你插入的序列，如果你PCR条件特异，一般P出来就是KO。如果你每只老鼠都做Western就太麻烦了，我现在也在做基因型的鉴定，就仅仅用PCR鉴定
2012-07-08 19:17
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