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【交流】XhoI,BamHI双酶切和pEGFP重组载体构建

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楼主

入门站友

1楼

这个帖子发布于7年零322天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

最近做一个克隆，目的基因大小为2000bp，选择的酶切位点是XhoI和BamHI。克隆载体为pcDNA3.1+和PEGFP-N1.
pcDNA3.1+载体成功构建，但是pEGFP载体的充值质粒却不能成功。双酶切能看见切下的小带（100bp以下），但是连接转化后，总是载体自连板上长的斑比添加了目的片段的板上长的菌斑多。做过空白对照，感受态和抗性没有问题。就算是载体没有完全切开，也不会导致对照组比实验组的菌斑还多呀。请高手指教。
酶切条件：TAKARA公司的酶，37度过夜（约10小时），50ul体系，DNA量按照其说明使用或稍微多一点。酶切时间3-5小时也试过，每次结果一样。载体换过一次，结果类似。
连接条件：NEB公司的酶，15ul，20度3小时。

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2012-03-06 11:11 浏览 : 3405 回复 : 7

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常驻站友

2楼

做啥对照，只要你的实验组有阳性克隆就好，送测序。

2012-03-06 16:48

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铁杆站友

3楼

Try to do gel purification of the pEGFP-N1 cut with BamH I + Xba I for cloning.

2012-03-07 00:18

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铁杆站友

4楼

载体完全双酶切但外源片段没有被完全双酶切，是导致载体自连板上长的斑比添加了目的片段的板上长的菌斑多的主要原因。

2012-03-07 10:08

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