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【求助】western blot

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haishangfeiniao

常驻站友

1楼

这个帖子发布于8年零215天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

问题已解决悬赏丁当:5

各位western blot高手好：
最近开始做western blot,遇到些问题，我先做的actin,不是曝不出来结果，就是有好几条带，感觉很抑郁，请教高手到底是什么问题。首先我说下我的步骤：
1.样品制备：抽取S180或是H22腹水2.5ml，4度离心，12000rpm，10min，弃上清，PBS洗细胞3次，每次都是4度离心，12000 rpm，10min，细胞最后用RIPA裂解液（含PMSF）6ml重悬，冰上裂解30min，并不时震荡使之充分裂解。
2.没有进行蛋白定量，我刚开始是先SDS-PAGE结束后直接染色，直到跑胶跑直了才开始继续往后做的，这个时候我已经把浓度摸好了；
3. SDS-PAGE, 分离胶10%，浓缩胶5%，上样量是8微升，共跑两块胶；浓缩胶80V，分离胶120V；
4. 电泳结束后，一块胶按照Marker切取40-55Kd位置的胶，4度转膜，130mA,1.5-2.0h;另一块胶，考马斯亮蓝染色；
5. 转膜后的PVDF膜丽春红染色（转膜前PVDF膜先用甲醇泡过的），可见清晰条带，跑的比较直，TBST洗至无色后，5%脱脂奶粉封闭1.5-2h；
6. 封闭液稀释的一抗4度冰箱孵育过夜（一抗是santa cruz biotechnology的，rabbit, 我是1:500稀释，因为放置了一年了，效价可能偏低了）（刚开始我直接用TBST稀释一抗的，后来改用封闭液稀释。TBST稀释一抗的时候，我会在封闭之后，一抗孵育之前先TBST洗膜5min的，而改用封闭液稀释后就没再用TBST洗膜了）；摇床转速25/min;
7. TBST洗3次，每次10min;
8. 封闭液稀释的二抗室温孵育2h（二抗是goat anti-rabbit,我是1:1000稀释的，也是因为放置了一年，效价偏低，才用的浓度高）（同样：刚开始用TBST稀释二抗的，后来改用封闭液稀释。TBST稀释二抗的时候，我会在封闭之后，二抗孵育之前TBST洗膜5min，而改用封闭液稀释后就没再用TBST洗膜了）;摇床转速25/min;
9. TBST洗3次，每次10min;
10. ECL显色（我一般根据荧光强度来定压片和显影时间的）
我的问题是：
1.我明明丽春红染色后条带很清楚很直，为什么有时候曝光出来的条带有歪的呢？
2.为什么我用同一个样品，同样的体积，同样的操作条件，有时候ECL加到膜上就看的到，荧光很强，有时候没荧光曝不出来呢？
3.为什么我的样品不管是S180的还是H22的，actin都不只一条带呢，老是有好几条带，这个是什么原因呢？封闭没封好？一抗二抗特异性不强？
这是我曝光的结果，请大家给分析分析原因。感激不尽！

未标题-1.jpg(152.61k)

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2012-05-05 21:51 浏览 : 2044 回复 : 8

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• 月薪从6500降到3000元的医学定向生，后来怎么样了？

19760608

入门站友

2楼

我的问题是：
1.我明明丽春红染色后条带很清楚很直，为什么有时候曝光出来的条带有歪的呢？
你看到的未必是抗体作用的蛋白

2.为什么我用同一个样品，同样的体积，同样的操作条件，有时候ECL加到膜上就看的到，荧光很强，有时候没荧光曝不出来呢？
Beta-Actin?

3.为什么我的样品不管是S180的还是H22的，actin都不只一条带呢，老是有好几条带，这个是什么原因呢？封闭没封好？一抗二抗特异性不强？
Santa Cruz 的抗体臭名昭著无人不知! Actin还算好的，你试试其他的，保管你眼花缭乱满世界的花花Bands。这不是调试block条件可以解决的问题，与二抗也毫无关系。赶紧换其他公司的单克隆抗体。我的经验：效果最好的是Sigma Anti-Mouse单克隆抗体（Cat. A1978）。

2012-05-05 23:42

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19760608 编辑于 2012-05-06 00:13

• 死里逃生的意识障碍

janlont

铁杆站友

3楼

1，正常。染出来的蛋白一般都不是你曝光出来的蛋白。而且丽春红染色只能粗略反应，曝光结果更细微。

2，也不奇怪，这说明你自己的WB操作技术不稳定。多练习。

3，很正常。有杂带主要是一抗的问题（任何抗体，当然也包括actin都可能出现此问题），但是只要能区分开，而且目的条带也正常，那么抗体就可以用。没必要换抗体。除非你分不清目的条带和杂带，才选择换抗体。

2012-05-06 08:46

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19760608

入门站友

4楼

janlont
1，正常。染出来的蛋白一般都不是你曝光出来的蛋白。而且丽春红染色只能粗略反应，曝光结果更细微。

2，也不奇怪，这说明你自己的WB操作技术不稳定。多练习。

3，很正常。有杂带主要是一抗的问题（任何抗体，当然也包括actin都可能出现此问题），但是只要能区分开，而且目的条带也正常，那么抗体就可以用。没必要换抗体。除非你分不清目的条带和杂带，才选择换抗体。

你发表文章时如果只截出这个Band的MW节段也可接受，那就无所谓。但若Reviewer要求全blot图像（我就被这样要求过），你就发上去遍布涂鸦令人目不暇接的全图？除非你把所有杂Band统统PS掉。话说回来要是这样，直接在空白里PS上去理想的Band不就得了？还费尽做试验干啥？具体到这个例子，地球人都知道Beta-Actin的典型图像就是漂亮的单Band，也看惯了。如拿出上面的图，换你当Reviewer会对试验的质量作何联想？又会怎样评价作者验证整个题目的态度？

2012-05-06 08:53

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19760608 编辑于 2012-05-06 09:08

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