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蛋白质和糖学

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论坛首页  >  蛋白质和糖学技术讨论版   >  Western Blot/IP
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【求助】western blot

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楼主 haishangfeiniao
haishangfeiniao
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这个帖子发布于7年零218天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:5
各位western blot高手好:
最近开始做western blot,遇到些问题,我先做的actin,不是曝不出来结果,就是有好几条带,感觉很抑郁,请教高手到底是什么问题。首先我说下我的步骤:
1.样品制备:抽取S180或是H22腹水2.5ml,4度离心,12000rpm,10min,弃上清,PBS洗细胞3次,每次都是4度离心,12000 rpm,10min,细胞最后用RIPA裂解液(含PMSF)6ml重悬,冰上裂解30min,并不时震荡使之充分裂解。
2.没有进行蛋白定量,我刚开始是先SDS-PAGE结束后直接染色,直到跑胶跑直了才开始继续往后做的,这个时候我已经把浓度摸好了;
3. SDS-PAGE, 分离胶10%,浓缩胶5%,上样量是8微升,共跑两块胶;浓缩胶80V,分离胶120V;
4. 电泳结束后,一块胶按照Marker切取40-55Kd位置的胶,4度转膜,130mA,1.5-2.0h;另一块胶,考马斯亮蓝染色;
5. 转膜后的PVDF膜丽春红染色(转膜前PVDF膜先用甲醇泡过的),可见清晰条带,跑的比较直,TBST洗至无色后,5%脱脂奶粉封闭1.5-2h;
6. 封闭液稀释的一抗4度冰箱孵育过夜(一抗是santa cruz biotechnology的,rabbit, 我是1:500稀释,因为放置了一年了,效价可能偏低了)(刚开始我直接用TBST稀释一抗的,后来改用封闭液稀释。TBST稀释一抗的时候,我会在封闭之后,一抗孵育之前先TBST洗膜5min的,而改用封闭液稀释后就没再用TBST洗膜了);摇床转速25/min;
7. TBST洗3次,每次10min;
8. 封闭液稀释的二抗室温孵育2h(二抗是goat anti-rabbit,我是1:1000稀释的,也是因为放置了一年,效价偏低,才用的浓度高)(同样:刚开始用TBST稀释二抗的,后来改用封闭液稀释。TBST稀释二抗的时候,我会在封闭之后,二抗孵育之前TBST洗膜5min,而改用封闭液稀释后就没再用TBST洗膜了);摇床转速25/min;
9. TBST洗3次,每次10min;
10. ECL显色(我一般根据荧光强度来定压片和显影时间的)
我的问题是:
1.我明明丽春红染色后条带很清楚很直,为什么有时候曝光出来的条带有歪的呢?
2.为什么我用同一个样品,同样的体积,同样的操作条件,有时候ECL加到膜上就看的到,荧光很强,有时候没荧光曝不出来呢?
3.为什么我的样品不管是S180的还是H22的,actin都不只一条带呢,老是有好几条带,这个是什么原因呢?封闭没封好?一抗二抗特异性不强?
这是我曝光的结果,请大家给分析分析原因。感激不尽!


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2012-05-05 21:51 浏览 : 1728 回复 : 8
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我的问题是:
1.我明明丽春红染色后条带很清楚很直,为什么有时候曝光出来的条带有歪的呢?
你看到的未必是抗体作用的蛋白

2.为什么我用同一个样品,同样的体积,同样的操作条件,有时候ECL加到膜上就看的到,荧光很强,有时候没荧光曝不出来呢?
Beta-Actin?

3.为什么我的样品不管是S180的还是H22的,actin都不只一条带呢,老是有好几条带,这个是什么原因呢?封闭没封好?一抗二抗特异性不强?
Santa Cruz 的抗体臭名昭著无人不知! Actin还算好的,你试试其他的,保管你眼花缭乱满世界的花花Bands。这不是调试block条件可以解决的问题,与二抗也毫无关系。赶紧换其他公司的单克隆抗体。我的经验:效果最好的是Sigma Anti-Mouse单克隆抗体(Cat. A1978)。
2012-05-05 23:42
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1,正常。 染出来的蛋白一般都不是你曝光出来的蛋白。而且丽春红染色只能粗略反应,曝光结果更细微。

2,也不奇怪,这说明你自己的WB操作技术不稳定。 多练习。

3,很正常。 有杂带主要是一抗的问题(任何抗体,当然也包括actin都可能出现此问题),但是只要能区分开,而且目的条带也正常,那么抗体就可以用。 没必要换抗体。 除非你分不清目的条带和杂带,才选择换抗体。
2012-05-06 08:46
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janlont
1,正常。 染出来的蛋白一般都不是你曝光出来的蛋白。而且丽春红染色只能粗略反应,曝光结果更细微。

2,也不奇怪,这说明你自己的WB操作技术不稳定。 多练习。

3,很正常。 有杂带主要是一抗的问题(任何抗体,当然也包括actin都可能出现此问题),但是只要能区分开,而且目的条带也正常,那么抗体就可以用。 没必要换抗体。 除非你分不清目的条带和杂带,才选择换抗体。

你发表文章时如果只截出这个Band的MW节段也可接受,那就无所谓。但若Reviewer要求全blot图像(我就被这样要求过),你就发上去遍布涂鸦令人目不暇接的全图?除非你把所有杂Band统统PS掉。话说回来要是这样,直接在空白里PS上去理想的Band不就得了?还费尽做试验干啥? 具体到这个例子,地球人都知道Beta-Actin的典型图像就是漂亮的单Band,也看惯了。如拿出上面的图,换你当Reviewer会对试验的质量作何联想?又会怎样评价作者验证整个题目的态度?
2012-05-06 08:53
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