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核酸技术

关注今日：1 | 主题：345352
论坛首页  >  核酸基因技术讨论版   >  质粒与DNA
该话题已被锁定 - 丁香园 , 2013-07-09 13:52
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【交流】“核酸杂交技术答疑专贴”：简单到杂交膜的选择都是一门学问！

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楼主 maibio
maibio
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  • 71楼
jp2004150222
谢谢啦，你说得对，应是用蛋白酶K缓冲液作为阴性对照，而不是用DNA dilution buffer与蛋白酶K缓冲液。因为DNA dilution buffer里面含有鱼精DNA，我的探针制备过程中因是超声，使得一些片段过小，用这些小的探针可能会与鱼精DNA杂交，增加了非特异性，从而使得阴性组在探针浓度过高时会出现假阳生结果。不知我分析的对不对

对，是有这个可能性，呵呵。
2012-04-01 10:43
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楼主 maibio
maibio
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  • 72楼
laokei
我做的是嵌合单抗的DNA残留量检测，一个剂量在几百毫克以上，注射一个剂量一百多毫升，而检测限在100pg/dose以下，这种情况怎么解决？不知道有没有遇到过这种情况？


谢谢提问！
注射一个剂量一百多毫升，100pg/dose,那是意味着100pg/ml,0.1pg/ul 在蛋白溶液里？这个检测灵敏度如果直接用样品点在膜上，用dot blot 是很难达到的。

唯一可以做的方法是首先对样本做核酸抽提后浓缩样本，然后用dot blot检测，但是这种方法最大的问题是在抽提过程中DNA也会有一定的损失。具体能否使用需要参考国家药典的最新要求。
2012-04-01 11:26
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laokei
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  • 73楼
这个确实是问题，也询问过罗氏的技术支持！目前也查询了好几种提取残留DNA的方法，在DNA提取过程中有一定的损失。在使用酚氯仿异戊醇抽提的方法处理后的样品，如果不用异丙醇沉淀，直接点膜的话，膜上有一定的扩散，分辨的也不清楚。而沉淀后就基本上看不清楚了，只有100pg以上的点能看清楚（我使用的是十分之一的剂量）。
国家药典的要求是用杂交的方法，听说要用荧光定量PCR，但这种方法现在对有些细胞还不成熟，试剂盒价格也非常贵，仪器就更不用说了。

  • qPCR_Assay_DNA_Isolation_AAPS_Biotech_2011.pdf(168.73k)
2012-04-01 12:16
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laokei
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  • 74楼
请问楼主：我用POD标记的二抗，用ECL来显色可不可以？我之前用的是AP标记的二抗，用NBT/BCIP显色，100pg以下的点有点看不清楚，后来想更进一步提高灵敏度，就用POD标记的二抗，用ECL来显色，但是做了一次，没有看到发光（我用POD标记的二抗直接点在膜上，加ECL能看到发光）。按罗氏的试剂盒，一般检测核酸是用AP标记的二抗，用CDP-start来显色，但由于我的AP二抗快用完了，而ECL能找到，所以就用了这样一种搭配。不知道这种搭配合不合理？
谢谢！
2012-04-05 10:16
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