我做5‘RACE的一点心得

花了2，3个月，我的5‘RACE试验总算成功了，有些心得体会与大家分享。我用的是Invitrogen公司的GeneRacer Kit，约5000人民币/kit，可做5次。
最初我严格按照说明上的要求，总RNA取其要求的最大量即5ug（非常少，沉淀后几乎看不到），再进行RNA脱磷酸反应，反应后用苯酚：录仿等沉淀rna；再进行mRNA脱帽反应，反应后用苯酚：录仿等沉淀rna；再用T4 RNA ligase连接脱帽mRNA至GeneRacer RNA OLIGO上，反应后再次用苯酚：录仿等沉淀rna；最后用superscript III 进行RT反应，最后用GeneRacer 5’primier及我的下游GSP用高保真酶进行PCR。
但由于说明上要求的总RNA实在太少，每次酶促反应后均要重新抽提沉淀rna（已去除酶等），几次一来后就看不到RNA沉淀了，RT-PCR结果为阴性。后来我考虑到酶的特点之一就是其有高效性，于是就不顾说明书上的要求，取总RNA的量远大与其要求（至少10ug），结果就出来了！！！
经验：1。总RNA质量要高，先电泳看28s18s，28s亮度应该是18s的2倍。
2。总RNA的量可远大与其要求的上限5ug，但要相应延长酶反应时间。
3。pcr条件要自己摸，gsp的量可参考其要求的量，但其要求的dNTP量似乎偏大，自己要摸一下的dNTP量。
4。一定要用高保真酶taq酶。
附上我的race pcr电泳图。