三个片断连接的心得
发布于 2004-11-06 · 浏览 1488 · IP 四川四川
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我前一段时间3个片断的连接一直没成功，现在终于做出来了，多种酶切鉴定是正确的，具体测序有没有碱基错误跟3个片断连接的成功不冲突，故将我从失败中得到的写出来与大家分享。
1.提高载体和插入大片断的浓度（我的是5kb和1.2kb），开始我用小量提取的质粒做酶切，其中1.2kb的做胶回收还要再进行一道酶切，再做一次回收，量就很少。我后来改用大量提取方法获得的质粒，再进行上述2道反应，回收的浓度较高。
2同样是为了提高上述片断的浓度，连接体系中没加一滴水。
3感受态用的菌种是JM109，而不是用BL21
4做转化时未用书上说的缓慢振摇，而是170rpm，1h
5铺平板前将转化的菌液4000g离心20sec，去上清，留下约100ul液体，重漩，取40ul加相应的抗生素铺板（平板不能搁置太久，新鲜配置的更好）。
每个人的状况不同，希望我的几点中的某一方面对大家有帮助
1.提高载体和插入大片断的浓度（我的是5kb和1.2kb），开始我用小量提取的质粒做酶切，其中1.2kb的做胶回收还要再进行一道酶切，再做一次回收，量就很少。我后来改用大量提取方法获得的质粒，再进行上述2道反应，回收的浓度较高。
2同样是为了提高上述片断的浓度，连接体系中没加一滴水。
3感受态用的菌种是JM109，而不是用BL21
4做转化时未用书上说的缓慢振摇，而是170rpm，1h
5铺平板前将转化的菌液4000g离心20sec，去上清，留下约100ul液体，重漩，取40ul加相应的抗生素铺板（平板不能搁置太久，新鲜配置的更好）。
每个人的状况不同，希望我的几点中的某一方面对大家有帮助
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 1488
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