转化老是不成功，各位大侠救救我吧

我做的是构建腺病毒表达载体，目的片段通过rt-pcr获得，其中胶回收、纯化及抽质料试剂盒来自中科开瑞，内切酶来自NEB，T4连接酶用的是invitrogene.
目的片段的引物设计5---3 F: GGG GTA C#CA TGG TCG TCG AGG ACA TCT CCC AT R: CCC A#AG CTT CTA GAG GGT GCT GCT GTC CAC TT #标记处为酶切位点，用的是KPN1及HINDⅢ两种内切酶，其中酶切条件是，双酶切，用公用buffer ，20个小时，37度，切载体只用8小时，最后一次连接时测OD：INSERT 0.016UG/UL VECTOR则为0.011UG/UL ,其中 INSERT 大概为400BP ，VECTOR为7.5KBP，连接条件：目的片段 3 微升 载体 12 微升，BUFFER为4微升，连接酶为1微升， 37度，20小时。感受态是小量制备，现做现用，用的是XL-10。
我已做了几十次转化了，每次均是寸草不生！！！（我用的是抗生素耐药筛选）， 粗略一算，我做这个转化反反复复已有两个月了，恳请各位高手指点迷冿，不胜感激！