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关于酶切后连接

发布于 2004-10-08 · 浏览 4733 · IP 福建福建
这个帖子发布于 20 年零 212 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做的是原核表达,我把目的片断(有BamH1和Sma1两个酶切位点,其中Sma酶切是平末端)用T载体克隆后再用这两个酶进行酶切并回收目的条带。然后用这两个酶对表达载体酶切,然后将酶切后的目的片断与酶切后的表达载体连接,可总是连接不成功。我的问题是:
1、是不是连接酶的问题?我用的是MBI的T4连接酶.我查到T4连接酶有不同的浓度,分为1U/微升、5U/微升、30U/微升不等,而我看资料好像做连接时T4DNA连接酶的浓度是用量1微升,浓度为0.5U,是不是这样?那么我该怎么选择?如果要稀释,该用什么稀释?这个问题是不是可能导致我连接失败的原因?
2、是不是平末端连接的问题?我用BamH1和Sma1双酶切目的片断和表达载体后,我想应该得到的是带有一个平末端和一个粘末端的目的片断、带有一个平末端和一个粘末端的表达载体吧?接下来我将这目的片断与这酶切后的表达载体连接,是否可以?我看资料好像有说粘末端需要的连接酶的浓度较低,而平末端需要连接酶的浓度较高;且连接平末端需要的连接酶应该含有PEG.而我用的连接酶就是一般的连接酶,这是不是导致失败的原因?请问遇到这种情况该怎么办?该用怎样的连接酶?以及酶的浓度如何?
做了很多次,将近两个月了也没有结果,实在是郁闷的很,请大家帮帮我,帮我度过这一难关吧!我刚进实验室,这方面知识实在贫乏,恳请大家的帮忙


最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 4733

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