为什么质粒酵母电转化不进去？？
这个帖子发布于 21 年零 81 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做了两次酵母电转化，一直转不进去，请各位大侠帮忙看看！！
（1）构建好的载体PGAPZα-A/ORF2用BspHI线性化,然后用酚氯仿抽提，双蒸水溶解。
（2）酵母(SMD1168H)感受态制备:取200微升菌种接到250ml的YPD培养基中，270rpm过夜培养，OD600=1.976
1500X5min ——>弃上清，用250ml冰冷的灭菌水悬浮——>1500X5min ——>弃上清，用100ml冰冷的灭菌水悬浮——>1500X5min ——弃上清，10ml山梨醇悬浮——>1500X5min——>弃上清，1.5ml山梨醇悬浮备用。
（3）电转化：取20微升感受态，加入5微升线性化载体混匀——加到0.15cm电转杯中——冰上放置5min——400V,LOW电阻，10uF电转化——静置2min——加入0.5ml冰山梨醇——涂YPDS(含Zeocin100ug/ml)——30度培养。
结果就是没有长出菌落，请问我操作的步骤哪一步可能存在问题！！
谢谢了！！！
（1）构建好的载体PGAPZα-A/ORF2用BspHI线性化,然后用酚氯仿抽提，双蒸水溶解。
（2）酵母(SMD1168H)感受态制备:取200微升菌种接到250ml的YPD培养基中，270rpm过夜培养，OD600=1.976
1500X5min ——>弃上清，用250ml冰冷的灭菌水悬浮——>1500X5min ——>弃上清，用100ml冰冷的灭菌水悬浮——>1500X5min ——弃上清，10ml山梨醇悬浮——>1500X5min——>弃上清，1.5ml山梨醇悬浮备用。
（3）电转化：取20微升感受态，加入5微升线性化载体混匀——加到0.15cm电转杯中——冰上放置5min——400V,LOW电阻，10uF电转化——静置2min——加入0.5ml冰山梨醇——涂YPDS(含Zeocin100ug/ml)——30度培养。
结果就是没有长出菌落，请问我操作的步骤哪一步可能存在问题！！
谢谢了！！！
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